[发明专利]血清中25‑羟基维生素D2/D3双流路平行液相色谱质谱联用含量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种血清中25-羟基维生素D₂/D₃双流路平行液相色谱质谱联用含量检测方法。属于分析检测技术领域。

背景技术

维生素D是一类脂溶性激素，对人体的骨骼健康，钙、磷的体内平衡调节起到重要作用，此外维生素D还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和肿瘤等疾病密切相关。维生素D的缺乏可导致骨骼发育受损，以及各类慢性疾病的发病风险增加，如类风湿性关节炎、软骨化、冠心病、糖尿病和肿瘤等。人体维生素D的来源主要有两个途径，一是通过膳食途径摄入的维生素D₂(酵母或真菌)和维生素D₃(鱼、鱼肝油或蛋黄)，二是机体经光照将皮肤中的7-脱氢胆甾醇转化为维生素D₃。

维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素D(25-OHD)，从而被机体转运或储藏，因此体内25-OHD含量可有效反映人体维生素D的营养状态。此外，25-OHD在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此25-OHD可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素D水平。

目前，25-OHD的检测方法有多种，包括免疫检测、HPLC法和LC-MS/MS方法等。其中，LC-MS/MS法具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的“金标准”。但是，现有的常规LC-MS/MS方法检测时间长，检测设备使用成本较高。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种血清中25-羟基维生素D₂/D₃含量检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

血清中25-羟基维生素D₂/D₃含量检测方法，包括步骤：

(1)样品前处理：向加入内标工作液的血清样品中依次加入饱和硫酸锌溶液和乙腈，震荡，静置，加入正己烷，震荡，高速离心，取上层有机层，吹干，复溶配成甲醇溶液；

(2)利用液相色谱串联质谱法进行分析检测，其中，液相色谱采用第一平行液相和第二平行液相进行双样品交替分析，任一平行液相分析的同时另一平行液相洗平衡，任一平行液相完成数据采集时，另一平行液相立即开始采集数据，以实现连续数据采集，流动相包括A相和B相，A相为质量浓度0.1％的甲酸水溶液，B相为含质量浓度0.1％的甲酸和2mmol/L乙酸铵的甲醇溶液；分析和洗平衡的梯度洗脱时间程序分别如表1和表2所示。

表1.分析的梯度洗脱时间程序

表2.洗平衡的梯度洗脱时间程序

优选的，步骤(1)的具体方法是：取100μL血清样品于1.5mL离心管中，加入10μL内标工作液，充分混匀；再加入饱和硫酸锌溶液100μL：加入200μL乙腈；剧烈震荡30秒，室温静置15分钟；加入1mL正己烷，剧烈震荡30秒，14000g以上离心5分钟；取最上层有机层600μL，室温下氮气吹干，加入75％甲醇溶液200μL，充分混匀30秒。

进一步优选的，所述内标工作液的配制方法如下：用甲醇配制浓度为1000μg/mL的D6-25-OHD₂和D6-25-OHD₃的混合内标储备液，再用甲醇稀释为浓度为25ng/mL的内标工作液。

优选的，步骤(2)中的液相色谱采用岛津Nexera MX系统。

优选的，步骤(2)中的质谱采用三重四极杆质谱仪。

优选的，步骤(2)中的液相色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack XR-C8(2.0mm I.D.×50mm L.，2.2μm)

流速：0.4mL/min

柱温：25℃

进样量：20μL

自动进样器温度：4℃

阀切换时间：0.15min.。

优选的，步骤(2)中的质谱条件如下：

表3.MRM参数

本发明的有益效果：