[发明专利]一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法

权利要求书

1.一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1,进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；

步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；

步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH₄Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；

步骤S4，先加入1/3体积的5mol/L NaCl；再加入1/5体积的30％PEG6000和1.5mol/LNaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；

所述步骤S3和步骤S4之间还包括步骤F:加入RNase A以去除RNA, 所述RNase A 的终浓度为10ug/mL；

步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒；

所述步骤S2中，所述NaOH-SDS溶液为0.2mol/L NaOH和 1％SDS的新鲜配制的混合溶液;

所述步骤S2中，在离心之前加入了pH4.8、预冷的3mol/L KAC溶液;

所述步骤S3中，所述TE溶液为pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl与1mmol/L EDTA的混合溶液；所述NH₄Ac溶液的浓度为10mol/L。

2.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，在所述步骤S1具体包括：在含有抗性LB平板上挑取目的菌落，取适量的目的菌落接种于含有抗性LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，将过夜培养菌液全部倒入离心瓶中，离心，弃上清液，用振荡器打散细胞，在振荡状况下逐步加入TE溶液；直到细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物。

3.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S5中，用70%乙醇洗涤沉淀的次数不小于两次。

4.根据权利要求1或2所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，离心的温度为4℃。