[发明专利]一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法

说明书

本发明涉及一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括先通过经典碱裂解法获得粗分离的质粒DNA，然后依次加入异丙醇、NH₄Ac溶液、RNase A、NaCl，再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，期间使用TE溶液溶解沉淀，通过无水乙醇重新沉淀，通过70%乙醇洗涤沉淀并配合离心操作，干燥后最终用TE溶液溶解沉淀，获得目的质粒。本发明能很好的去除内毒素对质粒DNA的污染，本发明所使用的所有试剂均为实验室常备的化学试剂，操作方法简洁，易于掌控，适合大规模质粒的提取。本发明所获得的质粒浓度可达5mg/mL，且内毒素低于5EU/μg，质粒可用于酶切、DNA序列的测序、细胞转染、病毒包装以及临床动物免疫实验。

技术领域

本发明涉及质粒的提取方法，尤其涉及一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法。

背景技术

质粒是染色体外能进行自主复制的遗传单位，是可以把外源基因导入细菌进行扩增和表达的载体，是基因工程的主要工具。应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。研究表明，高质量的质粒是细胞转染、核酸疫苗、基因治疗等成功的基础。随着基因重组药物的研究和应用的快速发展，对重组质粒的需求量不断增加，常规的实验室制备方法已经不能很好达到要求，因此，摸索一种可靠的大规模的质粒提取方法具有重要意义。

目前常见的质粒大量提取的方法有分子克隆提供的碱裂解法、煮沸裂解法、商业化的试剂盒法。

传统的碱裂解法指用碱和SDS处理大规模细菌培养物，分离质粒DNA，是目前应用最为广泛的制备质粒DNA方法。但该过程不能对内毒素进行去除，内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，为一种热源物质，含有内毒素的物质一旦注入动物体内可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及散播性血管内凝血等毒性作用；在分子生物学实验中，内毒素的存在会降低质粒的转染效率和细胞的表达效率。

煮沸裂解法对温度控制要求较高，使得煮沸法在实验室的制备中稳定性较低，污染不易去除，不适合大规模质粒的提取。

试剂盒方法快速但费用高，不适于大规模质粒的提取。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，既能去除内毒素，又适合大规模质粒的提取。

本发明是这样实现的：一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括以下步骤：

步骤S1，进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；

步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；

步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH₄Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；

步骤S4，先加入NaCl；再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；

步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒。

采用上述技术方案，步骤S1为质粒的培养方法。步骤S2为常规的碱裂解法。步骤S3中，高浓度NH₄Ac溶液的加入使蛋白杂质很好地沉淀，通过乙醇沉淀去除了残留的异丙醇对质粒的影响。步骤S4对内毒素进行了去除，提高了所提取质粒DNA的质量。步骤S5通过70%的无水乙醇的洗涤沉淀，去除残留的盐离子对质粒DNA的影响。