[发明专利]一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法

权利要求书

1.一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；

(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；

(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；

(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。

2.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述用于进行荧光定量扩增的引物包括：

上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；

下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。

3.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述荧光探针(probe)的序列为：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。

4.根据权利要求1-3任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述提取病毒总RNA的步骤包括：取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mL Trizol，使其充分混匀后静置，并加入0.2mL氯仿，振荡后室温静置，离心取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，室温静置闭关离心弃上清，向沉淀中加入1mL 70％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，离心并室温干燥，并加入14μL DEPC水RNA充分溶解，即得。

5.根据权利要求4所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反转录步骤中，所述反转录体系包括：dNTPs 2.5mM、反转录酶M-MLV、5×反转录酶缓冲液，以及RNA抑制剂。

6.根据权利要求1-3任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述扩增NDV F基因步骤中，所用引物包括：

上游引物(pF3)：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；

下游引物(pR1)：5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。

7.根据权利要求1-6任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述RT-PCR反应体系包括：

2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL；

TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl；

Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl；

模板2μL(50ng)；

Probe 0.3uL；

正链引物0.4μL；

负链引物0.4μL；

补加ddH2O至20μL。

8.根据权利要求7所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述荧光PCR测定步骤中，循环参数为：经95℃10s、60℃15s、95℃20s共40个循环分析熔解曲线。

9.根据权利要求7或8所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述PCR扩增反应的退火温度为58℃。

10.权利要求1-9任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法在鸽新城疫病毒检测领域中的应用。