[发明专利]一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法

说明书

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法。本发明所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，利用荧光定量PCR技术对鸽NDV VI型进行特异性检测，而鸡新城疫强毒株和经典的LaSota疫苗毒株检测结果为阴性，为鸽NDV的临床检测提供了一种快速、准确、高通量的方法。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒VI型的方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的一种高度接触性、急性败血性传染病，其宿主范围非常广泛，可以感染鸡、鸽、鹅、鹌鹑等多种禽类，是影响养禽业发展最重要的疫病之一。NDV的基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，其可编码基质蛋白、融合蛋白等6种结构蛋白。研究表明，F蛋白在NDV致病过程中具有重要作用，其中，根据F蛋白裂解区域112-117位氨基酸序列差异将NDV分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。根据F基因47-420位核苷酸的遗传进化分析，发现鸽NDV区别于其他基因型的NDV，单独处于一个分支，并将其归为基因VIb亚型。因此，鸽新城疫病毒被认为是鸡源NDV的一种变异株，但与经典的鸡源NDV相比，其在致病性上存在很大差异，它只引起鸽子发病，而对鸡的致病力非常温和。

虽然当前养鸡场新城疫得到了有效预防控制，但由于缺乏防控鸽新城疫的专用疫苗，鸽新城疫仍在一些养鸽场爆发流行，给养鸽业造成了较大的经济损失。因此，能否及时、准确、快速进行确诊，对于鸽新城疫的有效控制具有重大意义。当前新城疫的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验等经典方法和RT-PCR等分子诊断技术。但经典的检测方法则需耗费较长时间，易耽误临床诊断；更重要的是，经典的检测方法虽然能检测出NDV，但较难区分出鸡源NDV和鸽源NDV，这对于新城疫的诊断及预防都会造成一定的影响。

荧光定量PCR技术(realtimefluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。RT-PCR检测技术具有特异性好、灵敏度高、高通量等优点，荧光定量PCR在RT-PCR基础上通过荧光染料及探针具有更高的灵敏性和特异性，并对扩增过程进行实时监测，可直接对病料组织进行快速、准确诊断。本发明研究了基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，为实际生产中尽早防控鸽新城疫病症提供一种新的技术手段。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，所述方法能更为准确的鉴定出鸽新城疫病毒。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；

(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；

(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；

(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。