[发明专利]一种快速检测体内DNA末端连接的方法

权利要求书

1.一种快速检测体内DNA末端连接的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)制备含不同末端的线性质粒DNA；

(2)线性质粒DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体；

(3)DNA末端连接的检测；

步骤（1）具体包括如下：选择3000~6000bp的载体为底物模板，以要切割的位点两侧的DNA序列设计PCR引物，在引物的末端添加能酶切产生所需DNA末端的限制性内切酶的内切位点序列，用高保真Taq酶Phusion进行常规PCR扩增获得所需DNA末端连接的底物，PCR产物纯化后，再经特定的内切酶BamHI酶切，获得BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA；

所述的PCR引物，是以BamHI 酶切位点设计， PCR引物分别为q65:ctGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG,q66: ctGGATCCAGTCGACTGAATTGGTTC；

步骤（3）具体包括如下：用荧光实时定量qPCR检测DNA末端连接的效率，分别设计两对引物，一对分别在线性质粒DNA末端的两侧：q8 ：GTGACATCTCCACTGACGTAAG和q9 ：GATGAACTTCAGGGTCAGCTTG，另一对在线性质粒DNA上：q10 ：CAAGCTGACCCTGAAGTTCATC和q11 ：GTTGTGGCGGATCTTGAAG；若同一条线性DNA末端相连，q8和q9引物经PCR扩增才有产物，若DNA末端没有相连，则q8和q9引物经PCR扩增没有产物；由此通过q8和q9引物PCR扩增产物量去检测拟南芥突变体对DNA末端连接效率；q10和q11引物在线性DNA上，无论DNA末端是否相连，经PCR扩增总有产物，用于线性DNA转化进原生质体的转化量的检测；

相对末端连接效率计算公式为:

BamHI 和GFP 分别表示引物q8+q9 和引物 q10+11的经qPCR检测的产物量，X 代表线性DNA质粒，O 代表环状DNA质粒；0h和24h 为转化后孵育的时间点；标准差计算公式如下:

，

其中野生型WT 的检测值设为 1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）具体包括如下：将制备的BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA 2ug加入圆底的2ml无菌EP管中，将100ul叶片原生质体加入到含DNA末端连接底物的EP管中，再在每管中缓慢加入110ul的过滤除菌的PEG溶液，在室温中孵育5-10min，再每管中加入440ul的W5溶液，缓慢混匀，200g离心2min，去上清，缓缓加入1ml W5溶液，混匀，25℃，黑暗培养，每个相同转化做两份，分别为孵育0h和24h后收样，提DNA。