[发明专利]一种快速检测体内DNA末端连接的方法

说明书

本发明提供一种快速检测体内DNA末端连接的方法，采用了制备含不同末端的线性质粒DNA线性质粒DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体；最后对DNA末端连接进行检测。本发明试验的供试样品微量即可，检测的样品稳定，可短期内反复检测，检测方法也相对简单，总体操作简单易行；同时利用PCR直接合成线性DNA片段，再经限制性内切酶酶切，即便酶切有部分不充分，也可从后序结果中鉴定出来，很好避免假阳性结果的出现，且结合qPCR能灵敏的检测出DNA末端连接的效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种快速检测体内DNA末端连接的方法。

背景技术

基因打靶（gene targeting）是指在内源目标基因处产生损伤，引入外源DNA片段，利用同源重组（homologous recombination, HR）的修复机制改变生物体的内源目标基因，旨在定点改造生物遗传信息，对遗传学的基础研究和改良生物题遗传性状都具有重要意义。而动植物等高等生物偏向于利用非同源重组机制即非同源末端连接（non-homologousend joining， NHEJ）去修复DNA损伤，若能在一定程度上抑制非同源末端连接或诱导同源重组，可在一定程度上提高基因打靶的效率。对非同源末端连接及同源重组及机制的研究对进一步提高基因打靶的效率意义重大，而对DNA末端连接效率及方式的鉴定对研究DNA重组机制十分重要。DNA末端连接的检测方法可分为体外和体内检测。体外检测是指将制备的活性蛋白与DNA末端连接底物建立体外连接体系，通过特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。虽然体外检测相对简单易行，但它并不能完全模拟生物体内环境，可能并不能真实的反映生物体内的反应情况。体内检测即指检测生物体活体细胞内建立DNA末端连接检测体系，通过表达产物（通常为荧光）的检测、特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。体内检测完全利用生物体建立检测体系，能更真实的反映DNA末端连接的情况，据目前报道，DNA末端连接的体内检测体系大约分以下两种方案模式。下面将分别详述。

方案一是连用可诱导表达的核酸限制性内切酶（如I-SceI等）载体及含该核酸限制性内切酶的酶切位点的报告基因（通常为荧光或荧光素酶）载体转化供试体，再通过对报告基因的产物检测去分析DNA末端连接。主要流程为构建可诱导表达的核酸限制性内切酶载体和含该核酸限制性内切酶的酶切位点的报告基因载体，内切酶的酶切位点在可检测的报告基因内或在控制可检测的报告基因的调控基因内等，将构建的诱导表达内切酶载体与含内切位点底物的报告载体皆转入供试体内，诱导内切酶表达后，产生断裂的DNA末端，经一定时间孵育后，DNA末端反应底物被细胞所修复，重新发出荧光，利用荧光检测系统（荧光显微镜、流式细胞仪、荧光素酶检测仪等）检测、核酸电泳、PCR技术及测序等分析其末端连接效率与形式。

方案二是体外制备线性的DNA末端连接底物，瞬时转化供试体，再通过特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。主要流程为构建含能不同限制性内切酶酶切位点的载体，这些不同限制性内切酶酶切相应底物能产生不同DNA末端，将载体转入大肠杆菌，利用大肠杆菌扩增体系，获得环状DNA产物，再用相应限制性内切酶酶切环状DNA得到含不同DNA末端的线性DNA，将含不同DNA末端的线性DNA转入供试体，经一定时间孵育后，DNA末端反应底物被转化细胞所修复，特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。

上述方案一能很好模拟体内DNA末端连接环境，但其操作相对复杂，将两个载体转入供试体的效率往往不高，对供试体的转化效率及筛选有较高要求，耗时也长，此外荧光检测对产物量有一定要求，否则达不到荧光检测仪器的灵敏度；且荧光的检测也有时间限制，否则荧光将淬灭。