[发明专利]增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要是通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280的糖基转移酶表达基因中断缺失突变株NXJ-22中，利用强启动子kasOp*过量表达后修饰基因asm10，增强安丝菌素甲基转移效率，提高安丝菌素生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。

背景技术

安丝菌素是由珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成的DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种DM1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine（即T-DM1）已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真核生物，如真菌，酵母，昆虫等。

安丝菌素生物合成主要包括三部分：起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）的合成，聚酮链的延伸（I型聚酮合酶催化）和复杂的后修饰途径，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、N-甲基化（SAM依赖）或者糖基化形成安丝菌素，其中由糖基转移酶Asm25催化的N-糖基化反应为N-甲基化反应的竞争途径，生成分支产物-糖基化安丝菌素。虽然可通过糖基转移酶表达基因进行中断缺失，得到的突变株NXJ-22，使N位糖基化对N位甲基化途径的竞争被消除，但是，N位甲基化效率仍旧较低。通过现有技术公开的内容可知，后修饰途径的效率对于终产物的产量和活性都有着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于过量表达N位甲基转移酶表达基因asm10，通过加倍安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因，增强甲基转移酶基因表达水平，从而提高安丝菌素的产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种增强转录水平的高产安丝菌素菌株，其技术要点是：所述菌株的N位甲基转移酶过量表达。

进一步的，突变株由菌株ATCC 31280过量表达后获得。

另一方面，本发明提供了该增强转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1），构建用于加倍甲基转移酶基因asm10的整合型质粒载体；

步骤2），将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌NXJ-22中进行同源重组，并筛选基因过量表达的突变株。

进一步的，步骤1）中，质粒载体由质粒pDR3-K*重组获得。

进一步的，基因asm10来源于珍贵束丝放线菌ATCC 31565。

进一步的，在起始密码子前插入RBS位点序列ATCTGAGTTGAAGAGGTGACGTC。

进一步的，步骤3)中，通过抗性筛选和PCR验证获得过量表达asm10基因的突变株。

进一步的，质粒载体的构建通过在质粒的SpeI/EcoRI位点插入asm10的PCR片段（SpeI/EcoRI）。

此外，本发明还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将活化后的asm10基因过量表达突变株的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220 r/min条件下培养24 h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220 r/min的转速下培养24 h；按10%的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220 r/min的转速下发酵7 d后收集发酵液并进行萃取。

进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：

一级种子培养基包括TSB 3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括TSB 3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，MgCl₂ 2 mmol/L。