[发明专利]一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：包括PBS缓冲液、密度梯度分离液、红细胞裂解液、CD45免疫磁珠、孵育液、固定液、透化液、封闭液、抗荧光淬灭封片剂、抗体稀释液以及荧光抗体浓缩液，所述荧光抗体浓缩液中包含荧光染料pan-CK-AF488、CD45-PE和细胞核染料Hoechst33342。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：所述密度梯度分离液为淋巴分离液。

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂解液包括红细胞膜破碎剂，所述红细胞膜破碎剂包括pH值为7.4的氯化铵、碳酸氢钾和EDTA混合溶液。

4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：所述氯化铵的浓度为10g/L，所述碳酸氢钾的浓度为0.5g/L，所述EDTA的浓度为0.3g/L。

5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：所述CD45免疫磁珠采用直接法制备，包括以下步骤：

S10、将4.5μm磁珠与IgG抗原相结合形成复合物；

S20、将上述步骤制得的复合物溶于含有质量百分比浓度为0.05～5％BSA和3mmol/L EDTA的PBS溶液中，4℃中孵育2h。

6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测试剂盒，其特征在于：所述固定液为质量分数为1～6％的多聚甲醛水溶液。

7.一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S10、利用密度梯度分离液对血液样本进行离心处理，通过分离、富集循环肿瘤细胞；

S20、对富集得到的循环肿瘤细胞通过细胞核染料Hoechst33342、荧光抗体pan-CK-AF488和CD45-PE进行染色鉴定；

其中，所述检测以非治疗为目的。

8.根据权利要求7所述的一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：步骤S10中所述的循环肿瘤细胞富集过程包括如下步骤：

S1、PBMC分血：将密度梯度分离液和血液在淋巴分离管中混合，加入PBS进行稀释，400g下离心10min使样本分层，离心后共分为三层，底层红色部分为聚集的红细胞，中间位置略带白色的中间层为白细胞和循环肿瘤细胞，上层淡黄色部分为血浆成分，将红细胞层以上的液体部分全部转移，并用PBS冲洗管壁3次后合并洗液，红细胞层弃去；

将所述步骤S1中获取的样本100g下离心10min后弃去上清，按照1倍体积的新鲜全血，加入3倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀；冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的；

S2、收集细胞：4℃，450g离心10min以沉淀白细胞，小心吸弃上清液；向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞；

将所述步骤S2中获取的样本加入孵育液重悬并加入免疫磁珠，4℃低速共孵育50min，取出后置于磁力架上静置吸附磁珠，将含有循环肿瘤细胞的澄清液全部转移至另一个离心管中，于通风橱内加入2％的多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后弃去上清液。

9.根据权利要求7所述的一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：步骤S20所述的循环肿瘤细胞免疫染色过程包括如下步骤：

A、抗体染色液的配制：将荧光抗体浓缩液pan-CK-AF488、CD45-PE和Hoechst33342在抗体稀释液中预先配置成1mg/ml，避光保存；

B、染色：将样本用固定液先固定后先浸于透化液中充分透化，再转移至封闭液中封闭30min，分别将上述步骤中预先配置好的抗体染液滴加至样本区，避光孵育60min，抗体孵育完毕后将样本转移至黏附载玻片上，鼓风干燥，封片观察。

10.根据权利要求9所述的一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述步骤B中先通过Hoechst33342对细胞核染色，再通过anti-pan-CK-AF488和anti-CD45-PE进行细胞染色，对Hoechst33342、pan-CK-AF488阳性和CD45-PE阴性的细胞优先进行计数，细胞计数通过荧光显微镜进行，镜下观察以pan-CK-AF488+/CD45-PE-/Hoechst33342+为循环肿瘤细胞，以pan-CK-AF488-/CD45-PE+/Hoechst33342+为白细胞，以pan-CK-AF488+/-/CD45-PE+/-/Hoechst33342-为非特异性染色，其中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。