[发明专利]一个花椰菜器官发育调控miRNA序列及其应用

说明书

本发明公开了一个花椰菜器官发育调控miRNA序列及利用上述序列培养高植株、少分支转基因植物的方法，它包括如下步骤：（1）花椰菜总DNA提取；（2）花椰菜miRNA‑1前体的扩增；（3）花椰菜miRNA‑1植物过表达载体的构建及鉴定；（4）遗传转化；(5)miRNA‑1转基因拟南芥的抗性筛选及分子鉴定；（6）miRNA‑1过表达转基因拟南芥表型分析。结果显示，转基因植物植株高度显著高于野生型；转基因植物植株茎分支数显著少于野生型；本发明公开的miRNA序列及其利用序列培育高植株、少分支转基因植物的方法对于揭示miRNA在花椰菜器官发育中的调控机制，进而采用基因工程手段干预植物器官发育进程，培育符合育种目标的高植株、少分支作物或经济植物具有重要价值。

技术领域

本发明属于现代分子生物转基因植物技术领域，涉及生物技术中一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的miRNA序列及其在培育高植株、少分支转基因植物中的应用。

背景技术

MicroRNA (miRNA)是真核生物中内源性、非编码、并具有调控作用的一类小分子RNA。其作为转录后水平上的一种调控因子广泛存在于动植物中。在植物体中，miRNA 基因转录出前体miRNA (pri-miRNAs)， pri-miRNAs 在DCL1作用下被切割成成熟茎环结构前体(pre-miRNA)，pre-miRNAs继续被DCL1切割产生miRNA/miRNA* 双链分子。随后miRNA*链被降解, miRNA与AGO1(Argonaute 1)蛋白等一起形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex, RISC), RISC通过与靶基因mRNA结合进而对其进行切割或抑制其翻译，造成靶基因表达的沉默或抑制。miRNA 的这种调控方式在植物生长发育及逆境应答等多个过程中均发挥重要作用。

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，是重要的蔬菜作物，当前我国是世界上花椰菜种植面积最大的国家。但对花椰菜器官发育调控，特别是由miRNA介导的调控机制认识十分有限。借助现代分子生物技术和手段，可以对花椰菜器官发育中发挥重要调控作用的miRNA鉴定、分离。相关miRNA的获得及功能阐释对于揭示花椰菜器官发育过程中miRNA的调控机制及采用基因工程手段干预植物器官发育进程，培育符合育种目标的高植株、少分支作物或经济植物具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是公开一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用的miRNA前体(命名为miRNA-1)序列，并提供一种利用该前体序列，采用基因工程手段获得高植株、少分支转基因植物的方法和应用。为实现此述目的，本发明公开了如下的技术方案：

一个在花椰菜器官发育中发挥关键调控作用miRNA-1前体序列，它由序列5’ ATTTCAGGTGATGTAGTTGAGAAGTAGCTGTAAAGCTCAGGAGGGATAGCGCCATGTCTCACCGGTACTATAAAATGTTTGTATATCTATATTGGCGCTATCCATCCTGAGTTCTATGGCTTCTTCTTGCTTTTATCCTGAGAT 3’组成（SEQID NO：1）。

本发明进一步公开了一种利用上述miRNA前体序列培养高植株、少分支转基因植物的方法，它包括如下步骤：

（1）花椰菜总DNA提取；

（2）花椰菜miRNA-1前体的扩增

首先利用生物学软件设计带NcoⅠ和BsteⅡ酶切位点的引物：

上游引物：5’ CCATGGGTAGAGAAGAATCTGTAAAGCTCAG3’（SEQ ID NO：2）