[发明专利]一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用

权利要求书

1.一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到毕赤酵母而获得：

所述外源DNA为恶臭假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。

2.如权利要求1所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述外源DNA序列如Seq No.1所示。

3.如权利要求2所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre。

4.如权利要求3所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述酵母工程菌是所述表达载体pHKFA1-cre线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。

5.一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；恶臭假单胞杆菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-cre；

步骤三、表达载体转化及酵母工程菌获取：将表达载体pHKFA1-cre经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌GS115感受态细胞，培养后筛选阳性转化子，并对筛选的阳性转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子即为毕赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。

6.如权利要求5所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于：阳性转化子的筛选是在MD平板进行。

7.如权利要求5所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于：对阳性转化子进行的鉴定以cre-F和cre-R为引物进行PCR鉴定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。

8.一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于：该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶是由权利要求1-4中任意一项所述的酵母工程菌进行发酵而获得。

9.如权利要求8所述的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于，其发酵方法为如下：挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mM CuSO₄。

10.一种如权利要求8或9所述的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。