[发明专利]一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用。

背景技术

肌酐酶(creatininase；EC 3.5.2.10)是一种水解酶，属于脲酶相关的酰胺水解酶家族，分布于少数几种细菌中。肌酐酶的活性中心含有锌离子，肌酐酶的催化水解合成反应即催化环酰胺肌酐可逆的水解为肌酸。

血清中和尿液中肌酐测定可为临床评价肾小球滤过功能提供客观指标，因而是临床上常做的生化检验项目，传统的肌酐测定化学法由于反应特异性差，容易受到样品中的非特异性物质的干扰，正在逐步被酶学方法所取代。肌酐酶作用的底物具有特异性，底物只能是肌酐或者是肌酸，酶法检测肌酐有着反应特异性强，操作简单的优点，而作为其中的一个关键酶，肌酐酶在医学检测上有重要的应用价值。

在自然环境中，恶臭假单胞菌、脲节杆菌和烟草节杆菌等微生物的代谢物中都有发现肌酐酶。目前研究比较多的肌酐酶大多是野生菌中的肌酐酶，但野生菌培养困难，肌酐酶产量低，比酶活低，提纯存在困难。随着酶法检测肌酐试剂盒的开发，对于肌酐酶的需求越来越大，利用野生菌进行肌酐酶的生产难以实现工业化放大而且生产往往成本过高。

因此，构建出高表达具有良好性质的肌酐酶的工程菌，实现肌酐酶在工业中的生产，将可以大幅度降低生产成本。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供了一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其构建方法。

本发明所解决的技术问题还在于提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，利用本发明的酵母工程菌进行发酵而获得。

本发明所解决的技术问题还在于提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，所述酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到毕赤酵母而获得：

所述外源DNA为恶臭假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。

优选地，所述外源DNA序列如Seq No.1所示。

优选地，所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre。

优选地，所述酵母工程菌是所述表达载体pHKFA1-cre线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。

相应地，本发明还提供一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；恶臭假单胞杆菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre；

步骤三、表达载体转化及酵母工程菌获取：将表达载体pHKFA1-cre经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌GS115感受态细胞，培养后筛选阳性转化子，并对筛选的阳性转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子即为毕赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。

优选地，阳性转化子的筛选是在MD平板进行。

优选地，对阳性转化子进行的鉴定以cre-F和cre-R为引物进行PCR鉴定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。

另外，本发明还提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于：该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶是由上述方案中揭示的酵母工程菌进行发酵而获得。

优选地，其发酵方法为如下：挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mM CuSO₄。

再则，本发明还提供了一种本发明的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。

与现有技术相比，本发明优点在于：