[发明专利]用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用

权利要求书

1.用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列分别是：

EGFR外显子18正向引物：如SEQ ID No.1所示；

EGFR外显子18反向引物：如SEQ ID No.2所示；

EGFR外显子19正向引物：如SEQ ID No.3所示；

EGFR外显子19反向引物：如SEQ ID No.4所示；

EGFR外显子20正向引物：如SEQ ID No.5所示；

EGFR外显子20反向引物：如SEQ ID No.6所示；

EGFR外显子21正向引物：如SEQ ID No.7所示；

EGFR外显子21反向引物：如SEQ ID No.8所示。

2.权利要求1所述的特异性引物用于高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法快速筛查EGFR基因外显子18-21突变。

3.一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取外周血样品基因组DNA；

(2)合成权利要求1所述的特异性引物共4对；

(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；

(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生EGFR基因突变。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR的反应体系是：

总体积为15μL的反应体系包含：master mix 10μL；MgCl₂ 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNase free H₂O。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA 5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中样品基因组DNA的提取采用试剂盒提取。

9.权利要求1所述的特异性引物或权利要求4所述的检测方法在快速筛查EGFR基因突变检测试剂盒中的应用。

10.一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的特异性引物，以及PCR试剂、阴性对照、空白对照。