[发明专利]用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。尤其是涉及一种用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及其应用。

背景技术

近年来，我国恶性肿瘤的发生率和病死率呈明显上升趋势，已跃居我国居民死亡病因的首位。然而，对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断以及防治，尚无突破性研究，部分患者就诊时已处于中晚期，疗效较差。因此，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，是改善恶性肿瘤诊治疗效的有效出路。目前临床上，多采用血清学检测的方法监测血清或其他体液中的肿瘤标志物，动态地对肿瘤的存在、发生发展及预后做出判断。然而，任何一种科学指标都不是绝对的。肿瘤标志物的器官特异性和肿瘤特异性较差,既存在于肿瘤中也存在于正常人群和非肿瘤患者血液和体液中,每个人对于肿瘤标志物都有各自的基础水平,不能单凭超过参考范围而进行诊断。有时要借助相关辅助检查,对检测结果进行仔细分析后,才能提高对肿瘤的存在、发展及预后的实用价值。同时，肿瘤标志物浓度会受到体内代谢的很多因素影响，所以准确性也会受到影响。以肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)为例，除绝大多数肝癌病人的血清呈阳性外，还有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也会有大幅上升，因此不必一看到“阳性”就“色变”。当然，与此同时，甲胎蛋白阴性自感不适的患者也不能掉以轻心，还要依靠大夫联合多项检查直至细胞学、病理学检查等做进一步查实和鉴别。

基因是具有遗传效应的DNA片段，支持着生命的基本构造和性能。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。无论是碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中的氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使机体的表型出现异常。因此，对基因的突变进行检测，能够在疾病发生的早期阶段被检测出，有利于实现疾病的早发现，早诊断，早治疗。

HRM(高分辨率熔解曲线分析)是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。美中不足的是在进行未知突变筛查、扫描时，只能检测到有无突变，无法确定突变在DNA片段中位置。触底PCR(Touch down(TD)PCR)是一种特殊技术，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属于酪氨酸激酶受体，它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变,这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性密切相关。另外，大部分对EGFR-TKI治疗有效地患者最终都会对EGFR-TKI产生耐药性，而EGFR外显子20的体细胞突变是EGFR-TKI激发耐药的主要机制之一。外显子20的突变类型主要是T790M。这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄洛替尼出现激发耐药。因此，EGFR突变的检测对健康人群体检筛查、早期发现癌症或者癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。

发明内容