[发明专利]一种检测多种动物源性成分的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于检测用品技术领域，尤其涉及一种检测多种动物源性成分的试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，我国食品业进入了飞速发展的黄金时期，禽畜类肉制品及其制品丰富了广大人民群众的餐桌，然而肉制品屡屡出现掺假掺杂现象。狐狸肉、鸭肉冒充羊肉，牛肉汉堡肉饼掺马肉等事件层出不穷，肉制品掺伪造假也成为食品安全监管领域的热点和难点。随着现代肉类产品工业的发展，为了权衡肉制品口味、生产加工成本效益等因素，市场上越来越多的肉制品由多种类动物源性的肉加工制成，同一份样品往往需要同时开展多种动物源性成分的检测。

我国现行食品动物源性成分检测标准，都是利用PCR技术、实时荧光PCR技术开展动物源性成分目标基因的检测，这些技术每次仅能检测1至3种动物源性指标，无法满足3种以上动物源性成分的同时检测。现有检测方法对操作人员技术、实验室仪器设备配置要求较高，检测成本昂贵，很难满足批量大、高效快速的检验要求，无法满足市场监管、企业原料及成品质量实时控制的迫切需求。

发明内容

针对目前同时检测多种动物源成分的检测成本昂贵等问题，本发明提供一种检测多种动物源性成分的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测多种动物源成分的试剂盒，包括膜芯片，所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的探针组成；所述探针为检测猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针，内参探针，阳性探针和阴性探针，其序列如Seq No. 1-8所示，各探针的5’端带有氨基标记。所述猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针与各成分的线粒体基因结合。

可选地，支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙烯膜；最优选为尼龙膜。

作为优化，上述试剂盒还包括检测内参基因的内参探针、阳性探针和阴性探针的膜芯片，其序列如Seq No. 6-8所示，各探针的5’端带有氨基标记。内参探针检测18S rRNA基因。

更为优化地，上述试剂盒还包括5’端带生物素标记的阳性寡核苷酸单链DNA，其序列如Seq No. 9所示。阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针特异性结合，用于实验过程中的质量控制。

作为优化，上述试剂盒还包括碱性磷酸酶标记链霉亲和素，底物显色液，去活化液，杂交液，酶孵育液。

所述底物显色液包含0.15 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP），0.30 mg/mL氯化硝基四氮唑兰（NBT），5 mmol/L MgCl₂和100 mmol/L Tris-HCl，其pH为9.5，其中底物为BCIP和NBT。

所述去活化液含100 mmol/L NaOH；杂交液含2×SSPE和0.1wt%十二烷基硫酸钠（SDS）；酶孵育液含2×SSPE，0.5wt% SDS；酶孵育洗液为2×SSPE，所述2×SSPE缓冲液包含0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L NaH₂PO₄，20 mmol/L EDTA·Na₂，其pH为7.4。

可选地，上述试剂盒还包括猪、羊、牦牛、驴和小鼠成分的扩增引物对和内参扩增引物对，其序列如Seq No. 10-21所示；所述扩增引物对中反向引物的5'端带有生物素标记。

可选地，试剂盒还包括辅料，所述辅料包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶），DNA聚合酶（Taq酶）和10×PCR缓冲液。

所述10×PCR缓冲液含15 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，其pH为8.0-8.3。

上述试剂盒检测肉制品中猪、羊、驴、牦牛、鼠源性成分的最低检测限为0.1wt%。

采用上述试剂盒检测多种动物源成分的方法，包括以下步骤：

（1）提取样品中DNA；

（2）以步骤（1）中DNA为模板进行多重PCR；

（3）将步骤（2）中PCR产物与试剂盒中的膜芯片杂交并显色；

（4）对结果进行判断：

a）空白对照：PC显色，其余靶点无信号检出；

b）阴性对照：PC显色，内参有信号检出；

c）阳性对照：PC显色，内参有信号检出，靶点有信号检出；

同时满足以上三个条件的为有效实验，根据显色结果判断所含动物源性成分。

上述步骤（2）中DNA溶液的OD_260/280值为1.7-1.9。