[发明专利]增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物医药领域，具体说是一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株及其制备方法，主要通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中，利用红霉素抗性基因启动子增强PKS基因ansa9的表达水平，从而增强安丝菌素的生物合成能力，进而提高安丝菌素产量。

背景技术

安丝菌素是微生物来源的美登素类分子，属于I型聚酮化合物，由珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）产生，具有很强的抗肿瘤活性，在其多个组分中，安丝菌素P-3活性最强。目前，安丝菌素的多种抗体偶联分子已经进入不同的临床实验阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的trastuzumabemtansine（即T-DM1）已经成药上市。鉴于其重要的医用价值，安丝菌素产量的提高受到了广泛研究。

通过文献调研，我们发现聚酮酶（PKS）的活性会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量，而通过对生物合成途径中的限速酶表达基因进行过量表达是提高抗生素产量的一种常用策略。由前期转录数据分析我们发现，AP-3生物合成基因簇中的PKS基因ansa9转录水平很低，可能为AP-3生物合成瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株、该菌株其制备方法以及利用该菌株生产安丝菌素的方法。该突变菌株基于珍贵束丝放线菌（ATCC 31280）基因组中的安丝菌素生物合成PKS基因ansa9上游插入组成型强启动子-红霉素抗性基因启动子，使安丝菌素生物合成途径中的限速步骤基因加倍，增强聚酮合酶的表达水平，从而提高安丝菌素的产量。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株，其技术要点是：基因ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子。

进一步的，出发菌株为ATCC 31280。

另一方面，本发明提供了本发明提供了该增强聚酮合酶基因转录水平的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1），设计并扩增用于同源重组的同源左臂右臂，以及用于加强基因表达的组成型强启动子permE*；

步骤2），设计并构建用于通过同源重组在ansa9起始密码子前插入红霉素抗性基因启动子的质粒；

步骤3），将上述构建得到的质粒通过接合转移导入受体菌珍贵束丝放线菌ATCC 31280中进行同源重组；

步骤4），通过抗性筛选和PCR验证获得过量表达ansa9基因的突变株。

进一步的，质粒由pJTU1278的SacI/HindIII位点插入左右同源臂，并利用XbaI/BglII酶切位点插入启动子序列。

进一步的，启动子为红霉素抗性基因启动子。更进一步的，启动子的序列为：

GCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGTATGCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTAGGATCCACATATGTTGGGGA。

进一步的，用于通过同源重组插入启动子的同源臂左臂序列为：