[发明专利]一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法

说明书

技术领域

本发明属于蓝藻降解的微生物学领域，涉及一种利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制的方法。

背景技术

传统的浮游藻类微生物溶藻过程、溶藻效率的分析方法主要采用叶绿素(chl-a)含量测定法和藻细胞显微计数法。这2种方法具有工作量大，测量过程比较繁琐，耗费时间较长的缺点。尤其是chl-a含量的测定需要大量提取物，显微镜观测有时辨别不清，误差较大等不足。铜绿微囊藻有很强的荧光特性的藻胆蛋白，是一种卟啉类色素蛋白，卟啉具有π电子结构，在特定的波长照射下有很强的荧光反应。荧光光谱分析方法快速、准确、样品不需要特别处置、简单高效。藻细胞在新陈代谢过程中产生大量的藻类有机物(AOM)，分别为细胞代谢形成的胞外有机物(EOM)和细胞分解后释放的胞内有机物(IOM)，这些产物具有荧光特性，可通过三维荧光光谱进行定性分析。

目前已有学者对三维荧光考查菌株降解藻细胞的的研究进行了报道。《光谱学与光谱分析》2013年第33卷第1期167-171页报道了运用三维荧光光谱分析了Streptomyces sp.HJC-D1溶藻过程产物，分析结果显示HJC-D1溶藻产物DOM以类腐殖酸物质为主。《生物学杂志》2017年第34卷第2期21-25页报道了以三维荧光光谱技术为手段，通过区域荧光体积积分的方法，考察了介质阻挡放电等离子体损伤铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)过程中藻细胞荧光类内含物释放降解的规律。

本发明通过三维荧光技术，考察了铜绿微囊藻的荧光特性，对藻浓度进行了定量分析，构建了藻细胞数量-荧光强度、chl-a含量-荧光强度的关系模型；通过荧光光强变化考察了R1菌液的降解效果；并对Lysinibacillus macroides降解藻类产物进行了分析。

发明内容

本发明的目的：通过三维荧光技术解析微生物溶藻进程及机制。

本发明所采用的的技术方案如下：构建藻细胞数量-荧光光强、叶绿素a-荧光光强关系模型，验证荧光法测定藻液的准确性；通过Em 656nm下荧光激发光谱，考察了溶藻菌R1菌(Lysinibacillus macroides)的溶藻能力；根据菌藻混合液三维荧光光谱图，解析了藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物。

利用上述方法解析的方法微生物溶藻进程及机制，按照下述步骤进行：

(1)荧光法测定藻液的准确性验证：分别测定不同配比的铜绿微囊藻混合液的藻细胞数量、chl-a含量、荧光光度，并建立藻细胞数量-荧光光强模型、叶绿素a-荧光光强关系模型，从而验证荧光法测定藻液的准确性；

(2)溶藻菌R1菌(Lysinibacillus macroides)的溶藻能力：固定荧光发射波长(Em)656nm考察菌株混合液的荧光激发光谱，通过荧光光强考察R1菌溶藻能力；

(3)藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物考察：每隔一段时间测定菌藻混合液、菌液、及藻液三维荧光光谱图，对荧光图谱进行定性分析，推测溶藻产物及其溶藻活性物质。

本发明的有益效果：

(1)本发明验证了荧光法测定藻细胞浓度的准确性，验证了一种高效准确的藻浓度测定方法。

(2)本发明实践中的应用荧光法测定了R1菌溶藻能力与chl-a表征具有一致性，可作为溶藻效果的表征手段。

(3)本发明解析了利用三维荧光图谱解析微生物溶藻进程和机制，分析了藻细胞分泌物和溶藻(降解)产物，为利用溶藻菌溶藻的产物跟踪提供了借鉴。

附图说明

图1：溶藻产物荧光图谱。

具体实施方案

(1)关系模型建立：分别测定不同配比的铜绿微囊藻混合液的藻细胞数量、chl-a含量、荧光光度，并建立藻细胞数量-荧光光强模型、叶绿素a-荧光光强关系模型，从而验证荧光法测定藻液的准确性。

(2)R1菌溶藻能力考察：取10mL培养24h的R1菌液接种到100mL铜绿微囊藻溶液中，27℃、12h:12h光暗周期下培养，每天定期手动摇晃2-3次，分别取培养了0d、3d、7d、10d、12d的菌藻共培液进行三维荧光光谱分析及chl-a含量测定，计算溶藻率。扫描条件：固定发射波长为Em 656nm；Ex狭缝宽度为5nm；扫描速度为9600nm/s。

(3)溶藻产物考察：对降解后的藻液进行了三维荧光谱扫描。扫描条件：Em 280～550nm，Ex 220～800nm；狭缝宽度为5nm；扫描速度为24000nm/s。