[发明专利]一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途

说明书

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途，其方法包括以下步骤：提取待测植物的基因组DNA，获取得到序列矩阵；基于所述序列矩阵建立进化树；基于所述序列矩阵建立DNA条形码，分别取进化树和DNA条形码进行结果判断，如判断结果一致，则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。本发明建立一种标准方法准确确定牵牛属及近缘属的分类地位和物种，该鉴定方法采用叶绿体基因rbcL和核基因ITS独立分析使得到的结果相互印证，实验结论可靠且使用性更广。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。

背景技术

牵牛属是旋花科下的一个属，是一年生或多年生缠绕草本。该属约24种，广布于温带和亚热带。我国有3种，牵牛、变色牵牛、圆叶牵牛，南北均产。针对牵牛属及近缘属的相关植物，现有技术中一直存在这尚未确定分类地位的和物种的植物，例如针对国内常见的三种“牵牛”，即裂叶牵牛(Pharbitis hederacea Jacq.)、牵牛(Pharbitis nil(L.)Roth.)和圆叶牵牛(Pharbitis purpurea (L.)Roth)。林奈在1762年最早将它们归为ConvolvuLu属，Roth 1787年又最早将圆叶牵牛转移到番薯属(Ipomoea)，而Choisy随后又将牵牛和裂叶牵牛归到牵牛属(Pharbitis)。美国学者Austin在1986年的专著中认为这是三个独立的物种，而我国分类学者方瑞征等人在《中国植物志》(1976)及《Flora of China》(1995)中则认为他们是两个独立的物种，其中裂叶牵牛和牵牛应归为一个物种。上述方式的鉴定一般是基于形态学特征上的偏好凭经验和直觉做出的判断，没有可以重复的检验的方法。针对这三种牵牛长期的分类地位不确定性，还给诸多实践工作带来了混乱和冲突。如在《中国药典》中将三种牵牛的种子统称为“牵牛子”作为同一味药材认定，而在植物检疫中将圆叶牵牛从“牵牛”中区别出来认定为有害物种进行铲除和防范。

虽然国内有相关学者做了一些分子学方面的探索性研究，但是存在实验设计和方法学上的缺陷，且得到的结论和《中国植物志》或《中国药典》矛盾，因此无法作为参考标准。目前现有的研究一般都是一个物种及一个样品，这样的取样方法忽略了物种的种内遗传多样性和种间遗传多样性的关系，得到的结果只能判定物种之间的亲缘关系远近，不能判定其分类地位和物种，只有种内多样性小于种间多样性时其物种鉴定才能成立。因此建立一种标准方法准确确定牵牛属及近缘属尤其是上述的三种常见牵牛分类地位具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提出一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。该方法利用多个步骤包括：获取序列矩阵、建立进化树、建立DNA条形码分别独立分析进行鉴定，将获取的鉴定结果相互印证，具有重复性，使实验结论更可靠且使用性更广。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测植物的基因组DNA；以待测植物的基因组DNA为模板，以分子标记的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；

步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；

步骤3：基于所述序列矩阵建立DNA条形码，确定DNA条形码的间隔区的大小和位置；

步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2 和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

作为优选：所述步骤1中分子标记为叶绿体DNA的rbcL基因，所述rbcL 基因的上游引物的序列为SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列为SEQ ID NO： 2所示。