[发明专利]用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合

说明书

本发明公开了一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合。本发明还公开了用于鉴定乳粉中双歧杆菌菌株的HRM方法以及所述的SNP位点组合在鉴定乳粉中双歧杆菌菌株中的应用。通过本发明的SNP位点组合物和HRM方法，可以实现对乳粉中的双歧杆菌菌株的精确鉴定。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的说，是关于一种用于乳粉中双歧杆菌菌株鉴定的SNP位点组合。

背景技术

食品安全是关乎人民生命健康和社会和谐的重大战略问题。婴幼儿配方食品是部分婴幼儿的唯一食物来源，对婴幼儿健康及生命安全有重要影响。添加益生菌是婴幼儿配方乳粉的最新发展趋势。

2002年FAO/WHO对益生菌的定义为：益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主产生有益健康的作用。益生菌菌种(株)是益生菌制品品质控制中最重要的指标，最常用的为双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、乳球菌等。大量研究表明，双歧杆菌能抑制致病菌入侵和定植、调节机体免疫、降低胆固醇、抑制肿瘤发生等，在维持机体肠道微生态平衡和宿主健康方面发挥着重要的作用。因此，双歧杆菌成为近年来食品、药品研究开发的热点，部分菌株大量用于婴幼儿配方食品、保健食品、药品的生产中。但双歧杆菌发挥有益功能具有很强的菌株特异性，为此FAO/WHO益生菌评价指南中指出，精确的菌株识别是益生菌使用的前提，并要求食品标签要注明使用菌种的属名、种名和菌号等菌株名称，及货架期内活性菌数量。

为规范婴幼儿配方食品中的益生菌使用，我国卫生部于2011年10月发布《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》，规定允许使用：动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019和Bi-07、嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌LGG和HN001。其中双歧杆菌包括：动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019和Bi-07。尽管如此，目前市场上销售的婴幼儿配方乳粉存在菌株标签标示不明等诸多问题，使消费者陷入模糊消费的境地，也带来了安全隐患。例如，部分产品仅列明菌种名称，缺乏具体的菌株信息；部分标示名称为厂家自行命名，在卫生部公告和国际标准菌种库中无对应名称，无法对菌株进行溯源。因此，精确的菌株鉴定是益生菌婴幼儿配方乳粉安全监管的重要前提，有助于菌株的质量控制，以避免健康风险和误导性宣称；同时对了解市场产品中益生菌株与核准菌株的相符和变异情况，探索其可能的功能改变，具有重要的应用意义。

传统鉴定乳制品中益生菌的方法多以表型鉴定为主。结合形态学和生理生化特性，结果常因培养条件等因素出现偏差，对同种内菌株之间的鉴定较困难。如我国现行乳酸菌检测标准GB 4789.35-2010、GB/T 4789.34-2008为传统鉴定方法，仅能对双歧杆菌属进行常见种的生化分型，不能鉴定到菌株水平。

而分子生物学方法，无需进行繁杂的微生物培养，成为益生菌分类鉴定和溯源的主要手段。依据益生菌基因序列的特异性,可以进行属间、种间、亚种间、乃至菌株之间的区分。目前乳制品中双歧杆菌鉴定的常用方法，包括随机扩增多态性DNA分析(RAPD)；脉冲场凝胶电泳法(PFGE)；基于rDNA序列16S、16S-23S ITS测序方法等。其中，RAPD分辨率高，但对反应条件非常敏感，重复性差，很难将乳酸菌鉴定到种的水平。PFGE具备很强的鉴别能力，但操作繁琐，需要大型仪器支持，试剂成本高，常规实验室难以承受。而16S和16S-23S ITS方法仅能将细菌快速鉴定到菌种和亚种水平。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP指在DNA某特定位点上的单碱基突变，遗传稳定性高，是继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记,近几年被广泛用于生物以及医学研究的诸多领域。但普通实时荧光PCR仅能满足部分SNP检测需求。

因此，提供一种快速高分辨的双歧杆菌菌株水平分子分型方法具有重要的应用价值，为婴幼儿食品的风险发现、监测和安全监管提供技术手段和科学依据。

发明内容