[发明专利]3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：

检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，所述6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及

检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针，

所述检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变的引物及探针以及所述检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针分别如下表1所示：

表1：

。

2.一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有所述KRAS或BRAF基因突变的DNA与野生型DNA的混合液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，KRAS-G12A的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H1573的DNA，KRAS-G12S的阳性质控品DNA的来源为细胞系A549的DNA，KRAS-G12V的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H441的DNA，KRAS-G12D的阳性质控品DNA的来源为细胞系A427的DNA，KRAS-G12C的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H2122的DNA，KRAS-G13D的阳性质控品DNA的来源为细胞系HCT116的DNA，BRAF-V600E的阳性质控品DNA的来源为细胞系SK-HEP-1的DNA。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。

8.一种非诊断目的的3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用权利要求2至7中任一项所述的试剂盒配制KRAS和BRAF基因的每个突变位点的PCR反应体系；

将各所述突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；

将所述数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；

将得到所述扩增结果的所述数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判读每个所述突变位点的突变结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，所述荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图按顺时针方向依次分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(+)以及FAM(-)VIC(-)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，则根据所述荧光信号判读每个所述突变位点的突变结果的步骤包括：

若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定所述待测样本为阳性样本；

若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目3，则判定所述待测样本为阴性样本或低于检测限。