[发明专利]3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。该引物探针组合物包括：检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。上述引物探针组合物由于包含了与肠癌相关的7个常见突变位点，根据不同突变位点的引物及携带的不同荧光信号的探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D‑PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。

技术领域

本发明涉及3D-PCR检测领域，具体而言，涉及一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

根据国际癌症研究中心(IARC)预测，癌症发病人数在未来将会以每年3％～5％的速度递增，并有调查研究显示：中低收入国家癌症的发病率远高于发达国家，预计在2020年全球将有2000万新发病例的产生，死亡病例将达1200万。所以各国对癌症采取的预防措施刻不容缓。每年我国用于癌症病人的医疗支出高达800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近些年来，我国癌症的发病率呈逐年上升的趋势，尤其是肠癌发病率明显上升。

研究显示：肿瘤相关基因出现异常导致肿瘤细胞逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等现象的出现。而传统的肿瘤治疗主要针对细胞DNA，这种治疗手段往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，一些正常的细胞也被错杀。随着生物医药科技的快速发展，肿瘤的诊断方法和治疗手段不断提高，尤其是靶向治疗的出现，使肿瘤的死亡率得到了有效的控制。与传统的肿瘤治疗相比，靶向治疗具有高选择性和低毒性等优点，同时效果好、毒副作用小，可以长期指导临床用药，其作用机理是针对肿瘤细胞特有的靶点设计结合药物，从而达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用，对患者而言不仅延长了患者的生存时间还改善了患者的生存质量。

研究表明，KRAS基因的突变导致细胞逃逸凋亡，无限增值。在正常情况下，当细胞受到外界刺激后，生长因子等信号通路被激活，KRAS被激活的生长因子磷酸化后短暂活化，进而激活该信号通路中的下游信号蛋白，调控细胞生长增值，而后KRAS基因失活；当KRAS基因发生异常时，则不受上游生长因子的调控，从而导致下游细胞持续增值，并阻止细胞凋亡。KRAS突变多发生在第12位和13位密码子上，其中以G13D、G12D、G12A、G12C、G12S、G12V这6种突变类型最为常见，约占KRAS基因总突变的90％以上。

研究表明，BRAF基因在结直肠癌等恶性肿瘤中均存在不同程度的突变，突变频率约为15％左右，该突变主要发生在15外显子的激活区，其中90％以上的突变为15外显子1977位核苷酸上的T突变为A，导致其编码的氨基酸由缬氨酸突变为谷氨酸。BRAF编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导干预肿瘤细胞生长增值，最终导致肿瘤的发生。MAPK信号通路可正常调节细胞生长、分裂和分化，也可因BRAF家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症，其中BRAF V600突变体的产生显著增强了BRAF的活性，从而导致癌细胞分裂失控。

目前检测基因变异的技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法，方法简介于下：