[发明专利]一种茼蒿抑菌活性单体的制备方法

权利要求书

1.一种茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征是包括以下步骤：

S1：茼蒿茎叶预处理：称取新鲜的茼蒿茎叶20Kg，自然晾干后，于45-55℃鼓风干燥机中干燥10-14h，精确称取1.7-2.3Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛；

S2：浸提：加入48-52L的95％乙醇超声波辅助提取2-4次，每次1-3h，合并滤液减压浓缩，得到浸膏；

S3：大孔树脂柱层析：浸膏溶解于1.1-1.3L蒸馏水中，过滤，上清液上于D101大孔树脂柱中，依次用蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和90％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱1.9-2.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，分别回收每个梯度洗脱后的洗脱液，进行减压回收得到六个馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选出其中菌落直径最小对应的馏分A；

所述D101大孔树脂柱的直径为3.0-5.0cm，大孔树脂柱长度为23-27cm；

S4：C18中压色谱分离：取S3的A馏分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇:水梯度洗脱，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲醇、35％甲醇和50％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱0.8-1.2L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，各梯度洗脱后的洗脱液经HPLC检测，筛选合并相同馏分，形成不同梯度的B类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同B类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选菌落直径最小B类馏分中的一种，定义为B1馏分；

S5：葡聚糖凝胶LH-20柱层析：将S4中B1馏分经SephadexLH-20凝胶柱层析分离，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲和35％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的C类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同C类馏分的PDA培养基中，置于23-33摄氏度的恒温培养箱培养3-5d，筛选菌落直径最小的馏分，定义为C1馏分；

S6：半制备液相分离：S5所得C1馏分经半制备液相分离，依次用18％甲醇、27％甲醇、36％甲醇和45％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的D类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同D类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，菌落直径最小的馏分为茼蒿抑菌活性单体，所述茼蒿抑菌活性单体为绿原酸。

2.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S1中，将茼蒿茎叶于50℃鼓风干燥机中干燥12h，精确称取2.0Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛。

3.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S2中，加入50L的95％乙醇超声波辅助提取3次，每次2h。

4.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S3中，浸膏溶解于1.2L蒸馏水中；每个梯度洗脱2L溶剂，流速3.0mL/min。

5.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S3中，所述D101大孔树脂柱的直径为4.0cm，大孔树脂柱长度为25cm。

6.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S4中，每个梯度洗脱1L溶剂，流速3.0mL/min。

7.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S5中，流速3.0mL/min，将培养基置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d。

8.根据权利要求1所述的茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征在于：S6中，每个梯度洗脱1L溶剂，流速3.0mL/min，所述半制备液相使用的填料粒径为10μm，内径10mm，长度250mm。