[发明专利]一种原位快速检测细胞生物过程的方法

说明书

本发明涉及一种原位快速检测细胞生物过程的方法，基于活性细胞对含氘物质吸收、转化、代谢或存储后，会在细胞生物学过程的不同阶段中，在细胞中实现氘的原位标记，通过拉曼光谱对细胞进行检测，识别细胞中是否有氘的存在，进而得到关于细胞的生物化学过程、细胞性状或功能相关信息。本发明方法可用于细菌感染的药物敏感性测试、环境微生物代谢、人体细胞检测等生物学和医学领域。与现有技术相比，本发明方法具有探测细胞对于大多数重要生物分子的活性和代谢的潜力，且其允许研究使用更复杂的氘代物质，包括天然产物，药物和含有多种化学物质的氘化混合物。本发明方法在单细胞水平的自然条件下对细胞的功能研究是非常有价值的。

技术领域

本发明属于生物技术的检测技术，涉及一种原位快速检测细胞生物过程的方法，具体是涉及利用含氘底物选择性标记细胞生物过程，并通过单细胞拉曼图谱对标记的状态进行分析，从而识别细胞代谢、合成等性状或功能的方法及其在生物合成及医学检验等领域中的应用。

背景技术

细胞和分子生物学的研究推动了我们对地球上生命体的认识。通过修饰生物分子可用于在自然环境中监测细胞变化或功能。以2008年获得诺贝尔化学奖的绿色荧光蛋白(GFP)为代表的发现带来了化学生物学领域的革命。然而，许多小的生物分子和代谢物例如核酸、聚糖和脂质等不能用这种遗传编码的报告物来标记。尽管在过去几年通过选择性的修饰物种本身，让我们对细胞过程产生了新的见解，但是这些技术通常较慢，对生物化学反应选择性差，成本高昂且复杂。

代谢功能检测的关键是在维持生理条件的前提下快速和特异的反应。利用稳定同位素标记特定的目标微生物，并通过16S rRNA-SIP方法和NanoSIMS技术，可以对具有特定功能和性状的微生物进行识别和分析。但是16S rRNA-SIP只能结合13-碳的同位素使用，对15-氮等无能为力，限制了其使用，且其灵敏度较低，只能在种群级别对细胞进行分析。NanoSIMS技术灵敏度高，但细胞在研究过程中同16S rRNA-SIP技术一样被不可逆的破坏，且其高昂的设备价格及复杂的实验和数据分析操作，也限制了其使用。

氘是氢的稳定同位素，氘代不影响原子尺寸、分子形状、化学键长度或刚度(Franco,M.I.,et al.Molecular vibration-sensing component in Drosophilamelanogaster olfaction.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,3797-3802(2011))。氘水拉曼技术可以以非常高的灵敏度和选择性在单细胞水平上检测有活性的微生物(Berry,D.,etal.Tracking heavy water(D₂O)incorporation for identifying and sorting activemicrobial cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,E194-E203(2015))。细胞在含有氘水的培养基中培养之后，具有活性的微生物的拉曼光谱在2170-2300cm^-1之间产生一个C-D信号峰，由于没有被氘标记的细胞的拉曼光谱在这一区域通常没有任何信号，因此这一独特的C-D信号可用于高准确度和灵敏度的识别活性微生物。但是直到目前为止，通过添加氘水标记具有活性的细胞，具有以下几个问题：1)只针对微生物细胞，而没有适合真核生物细胞的方法；2)只针对已经被分离培养的经典微生物的纯培养菌株，没有针对未知的，尚未被培养的或者真实的混合菌群；3)微生物细胞被氘水标记的过程中其培养基都为人为配制的培养基，不能反应细胞真实的生存环境。

因此，开发一套基于原位氘标记单细胞的拉曼检测方法应用于生物、化学和医学领域，有很好的前景和价值。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种原位快速检测细胞生物过程的方法，本发明的方法基于氘同位素标记，并利用拉曼检测技术来实现细胞生物过程的原位快速检测。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：