[发明专利]猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物和探针；

所述引物的序列为：

正向引物：5'-ACTACCTCGGAACAGGACCTCA-3'；

反向引物：5'-AGACGCCTTTCTGACACCCA-3'；

所述探针的序列为：

5'-FAM-CGCCGACCTCCGCTATAGGACTCGT-BHQ1-3'。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.2mol/L，探针的浓度为0.15mol/L。

3.猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法使用权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒，检测方法包括以下几个步骤：

(1)提取待测样品中的RNA；设置阴性对照；

(2)制备RNA标准品；

(3)TaqMan荧光定量RT-PCR扩增反应：

扩增时使用的引物、探针分别为：

正向引物：5'-ACTACCTCGGAACAGGACCTCA-3'；

反向引物：5'-AGACGCCTTTCTGACACCCA-3'；

探针：5'-FAM-CGCCGACCTCCGCTATAGGACTCGT-BHQ1-3'；

扩增反应体系：2×RT-PCR buffer 10μL，E×Taq HS 0.4μL，逆转录酶混合物0.4μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，探针0.6μL，无RNA酶水5.8μL；

取步骤(1)中的RNA 2μL和阴性对照2μL分别加入总量为20μL的扩增反应体系中，将配置好反应体系的PCR管于42℃预热5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，57℃退火延伸20s，变性与退火过程延伸共40个循环；

(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。

4.根据权利要求3所述猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述待测样品阳性或阴性的判定标准为：

(1)阳性：检测样本Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长期；

(2)可疑：检测样本Ct值＞35.0，且出现典型扩增曲线的样品，进行重复试验；

(3)阴性：检测不到样本Ct值，且无明显的扩增曲线。