[发明专利]猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，尤其涉及猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪急性肠道传染病的一种常见病毒，易感染，发病率极高，且具有一定的季节性，其临床症状与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及口蹄疫病毒(FMDV)较为相似。

国内外对于猪流行性腹泻病毒的检测已有许多种方法，包括ELISA，RT-PCR及荧光定量PCR等，但不同的方法敏感性存在差异。在上述方法中，相比于其他方法，TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法具有较高的敏感性和特异性。目前，通过TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV的研究较少，现有的检测方法检测灵敏度差，阳性检出率低，重复性不好，不能很好地用于PEDV临床样品的诊断以及流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法，旨在解决现有的检测猪流行性腹泻病毒的方法其灵敏度差，阳性检出率低，重复性不好，不能很好地用于猪流行性腹泻病毒临床样品的诊断以及流行病学调查的问题。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒，所述的RT-PCR试剂盒包含引物和探针；

所述引物的序列为：

正向引物：5'-ACTACCTCGGAACAGGACCTCA-3'；

反向引物：5'-AGACGCCTTTCTGACACCCA-3'；

所述探针的序列为：

5'-FAM-CGCCGACCTCCGCTATAGGACTCGT-BHQ1-3'。

进一步地，所述引物的浓度为10μM，探针的浓度为5μM。

本发明的第二个目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，所述检测方法使用权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR试剂盒，检测方法包括以下几个步骤：

(1)提取待测样品中的RNA；

(2)制备RNA标准品；

(3)TaqMan荧光定量RT-PCR扩增反应：

扩增时使用的引物、探针分别为：

正向引物：5'-ACTACCTCGGAACAGGACCTCA-3'；

反向引物：5'-AGACGCCTTTCTGACACCCA-3'；

探针：5'-FAM-CGCCGACCTCCGCTATAGGACTCGT-BHQ1-3'；

扩增反应体系：2×RT-PCR buffer 10μL，E×Taq HS 0.4μL，逆转录酶混合物0.4μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，探针0.6μL，无RNA酶水5.8μL；

取步骤(1)中的RNA 2μL和阴性对照2μL分别加入总量为20μL的扩增反应体系中，将配置好反应体系的PCR管于42℃预热5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，57℃退火延伸20s，变性与退火过程延伸共40个循环；

(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。

进一步地，所述待测样品阳性或阴性的判定标准为：

(1)阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

(2)可疑：检测样本Ct值大于35.0，且出现典型扩增曲线的样品，进行重复试验；

(3)阴性：检测不到样本Ct值且无明显的扩增曲线。