[发明专利]一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法

权利要求书

1.一种视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，包括：

对视网膜于细胞分离、传代培养及鉴定；

分别通过TGF-β₂和胎牛血清对视网膜干细胞诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定；

对比观察TGF-β₂与胎牛血清分化细胞的程度及数量的不同。

2.如权利要求1所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

对视网膜干细胞分离、传代培养及鉴定包括：

对视网膜干细胞进行分离，获取到所述视网膜干细胞的原代细胞；

对所述视网膜干细胞的原代细胞进行传代培养；

对培养的视网膜干细胞进行鉴定。

3.如权利要求2所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

在分别通过TGF-β₂和胎牛血清对视网膜干细胞诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定过程中，

通过所述TGF-β₂对选取的传代培养的第六代视网膜干细胞进行诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定；

通过所述胎牛血清对选取的传代培养的第六代视网膜干细胞进行诱导分化，并对诱导分化结果进行鉴定。

4.如权利要求1所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

在对视网膜干细胞进行分离之前，先进行视网膜取材，其中，

2.5％戊巴比妥纳2ml注射孕昆明小鼠的腹腔，并脱颈处死；

然后浸入75％酒精中浸泡，15分钟后取出动物移至无菌手术台；

打开腹腔取出双角子宫，浸入4℃无菌生理盐水，取出胚胎，剖出胎鼠眼球；

将胎鼠眼球置于少量生理盐水的培养皿内，并去除眼球外组织和视神经，沿角巩膜缘剪开眼球，去除晶状体和玻璃体；

翻转眼杯，取睫状体部组织及视网膜色素层，移入装有培养液的离心管中。

5.如权利要求2所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

在对视网膜干细胞进行分离的过程中，

打开放置视网膜的离心管，加入胶原酶消化1h后用吸管轻轻吹打，将组织打碎后，1000r/min离心3分钟；

弃上清，加入0.25％胰蛋白酶的混合消化液5ml，37℃条件下震荡消化5分钟；

如有单细胞释出，加入培养液5ml稀释，再加以吹打5min后1000r/min离心5分钟，弃上清；

加入视网膜干细胞培养液5ml中止消化，继续用吸管轻轻吹打5min；

采用80目及200目不锈钢滤网先后过滤，制成单细胞悬液。

6.如权利要求5所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

取所述单细胞悬液0.5ml加入试管中，加入等体积0.4％台盼兰染液，染色2-3分钟；

吸取混合后的悬液涂于加有盖玻片的血球计数板上，1分钟后计数100个细胞，未着色的为活细胞，死细胞染成蓝色；

其中，细胞活力＝活细胞/细胞总数×100％。

7.如权利要求5所述的视网膜干细胞定向分化为视网膜细胞的诱导方法，其特征在于，

通过细胞计数确定细胞接种密度，具体步骤如下：

将血球计数板及盖片擦拭干净，并将所述盖片盖在所述血球计数板上；

将所述单细胞悬液吸出少许，滴加在所述盖片边缘，使所述单细胞悬液充满所述盖片和所述血球计数板之间；

静置3分钟，显微镜下观察，并计算所述血球计数板上的四大格细胞总数，其中，按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000；

将细胞悬液稀释到密度为5×10⁴/ml，然后接种于25ml培养瓶；

所述培养瓶中为完全培养基：DMEM/F12，1％B27，bFGF，将所述单细胞悬液放在37℃，、5％CO₂培养箱中培养。