[发明专利]一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法

权利要求书

1.一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：将扣囊复膜酵母的糖化酶（GA）和黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx）编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合，利用毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和GOx-DocT；利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白cohesin结构域CohC和CohT按比例可控共展示在酿酒酵母细胞的表面；将GA-DocC和GOx-DocT 融合蛋白与展示有支架蛋白的细胞进行孵育，通过cohesin-dockerin的特异性作用将GA和GOx按比例共展示在酵母细胞表面，再将共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学淀粉传感器，实现对样液中葡萄糖或淀粉的定量检测。

2.按权利要求1所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：采用所述酵母细胞共展示顺序酶修饰的电极为工作电极,以饱和甘汞电极（SCE）为参比电极、铂丝为对电极，以0.1 M的 pH 5.0的柠檬酸盐缓冲溶液作为电解液，三电极连接至电化学工作站，在施加电位–0.4 V vs SCE下，利用i–t法测定传感器对淀粉标准溶液的电流。

3.按权利要求1所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：利用a凝集素锚定蛋白将所述展示酶可控展示于酿酒酵母细胞的表面，GA和GOx摩尔比为1:1、2:1或3:1。

4.按权利要求3所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述GA和GOx摩尔比为2:1。

5.按权利要求3或4所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：将酵母表面按比例共展示GA和GOx的菌株分别修饰在经还原氧化石墨烯(RGO)滴涂的玻碳电极(GCE)上,所得传感器表示为yeast–GAGOx(n:1)/RGO/GCE，其中n为1、2或3。

6.按权利要求5所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述经处理的电极为

1）将玻碳电极用氧化铝粉末打磨，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗，放在氮气下吹干，备用；

2）将2 mg还原氧化石墨烯(RGO)加入1 mL的1 mg/mL的聚丙烯酸水溶液中，超声分散均匀，将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗, 然后重新超声分散均匀备用；

3）将上述获得分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，获得表示为RGO/GCE的电极；然后滴涂yeast–GAGOx菌株，获得yeast–GAGOx(n:1)/RGO/GCE传感器。

7.按权利要求6所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述传感器使用之前，滴涂0.05% wt的全氟磺酸树脂膜（Nafion）到电极表面。