[发明专利]一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法

说明书

本发明属于电化学生物传感领域，具体是指一种基于微生物表面可控共展示顺序酶，构建顺序酶电化学传感器检测糖的方法。将葡萄糖氧化酶(GOx)单展示于酵母菌株表面，或将糖化酶(GA)和GOx按比例共展示于酵母菌株表面；再将表面单展示或共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学传葡萄糖感器或电化学淀粉传感器，分别实现对样液中葡糖糖或淀粉的定量检测。本发明获得的传感器，为单酶传感器难以进行的组分检测提供了一条有效途径，可望广泛应用于生物质原料预处理、生物能源、食品发酵、医药、化工等工业生物过程的优化与控制及临床检验等领域。

技术领域

本发明属于电化学生物传感领域，具体是指一种基于微生物表面可控共展示顺序酶，构建顺序酶电化学传感器检测糖的方法。

背景技术

电化学生物传感器自上世纪60年代酶电极问世以来，其技术研究和应用获得了巨大的发展。固定化酶电化学生物传感器具有特异性强、稳定性好、准确度高、响应速度快、测定成本低、结果准确的优点，可实现对复杂样品(浊度、颜色等)中特定生化组分的快速测定。顺序酶传感器(sequential enzyme biosensor)指通过多种相关酶顺序、协调的完成一系列催化反应，并结合换能器完成单酶传感器难以实现的检测的装置。顺序酶传感器的制备一般是通过化学交联法、包埋法等将几种酶同时固定在电极上，由于不同酶与交联分子的亲和性不一样，导致固定之后各种酶之间的比例难以控制，检测结果的准确度易受影响。并且多种酶之间的空间位置和取向难以控制，固定之后酶的活性中心的分布呈现无序状态，影响总反应的速率。近几年，通过改善酶的固定方式，发展了多种双酶传感器，并一定程度上提高了传感器的稳定性。但是过度的化学交联会部分损失酶的活性，降低检测的灵敏度。通过分子水平操控，可以有效的保留酶固定时的活性和控制酶的空间位置，然而目前的研究仅用在单个酶分子上，对顺序酶传感器的改善效果微乎其微。

多种酶随机共展示体系，相对于传统的将商品化的酶通过化学交联固定在电极上，避免了过度的化学交联，使酶的稳定性得到改善，保证功能酶之间有效的比率和在空间上有效的取向及距离，使传感器的性能得到了一定的改善。但是酶随机共展示体存在明显的不足，如融合蛋白的构建复杂，酶表达效率低，顺序酶融合蛋白固定在电极时仍然使用化学交联剂，如此所构建的传感器的灵敏度低，检测限较高。因此，发展一种更为简易的、多种酶比例可控的顺序酶共展示全细胞，是解决顺序酶电化学传感器瓶颈问题的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的顺序酶传感器检测糖的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，将葡萄糖氧化酶(GOx)单展示于酵母菌株表面，或将糖化酶(GA)和GOx 按比例共展示于酵母菌株表面；再将表面单展示或共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学传葡萄糖感器或电化学淀粉传感器，分别实现对样液中葡糖糖或淀粉的定量检测。

采用所述酵母细胞单展示或共展示顺序酶修饰的电极为工作电极,以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极、铂丝为对电极，以柠檬酸盐缓冲溶液作为电解液，三电极连接至电化学工作站，在施加电位–0.4V vs SCE下，利用i–t法测定传感器对淀粉标准溶液的电流。

所述电化学淀粉传感器中共展示酶分别来源于扣囊复膜酵母的糖化酶(GA)编码基因和黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOx)编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合。

较佳的，所述可控的顺序酶共展示系统，其特征在于，利用毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和GOx-DocT。

较佳的，所述可控的顺序酶共展示系统，利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白cohesin结构域CohC和CohT按照可控的比例共展示在酿酒酵母细胞的表面。