[发明专利]一种小花万代兰种苗组织培养繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护生物学和生物技术领域，特别涉及一种小花万代兰种苗组织培养繁殖方法。

背景技术

小花万代兰（Vanda coerulescens Griff.）是兰科万代兰属植物，分布于印度东北部、缅甸、泰国，以及中国云南的西镇康、澜沧、墨江、思茅、景洪、勐海、勐腊、元江、元阳等县；生于海拔700-1600米，附生于疏林中树干上。为附生兰，茎粗壮，长8-30厘米，叶多枚，二列，先端有不规则缺刻；总状花序1-2个，长达36厘米，具多花，花色白色带淡蓝色，花期3-5月，国家二级保护植物，具有重要的育种、观赏、科研、保护等价值。但由于人们过度的采伐以及其生长环境发生变化，野外的小花万代兰种源稀缺，因而需要对其进行人工繁殖，一方面除了满足市场以及育种、科研的需求外，另一方面可将人工繁殖的种苗回归原产地放养，令其能自然繁殖，扩大其种群数量，极好地保护该物种的多样性。

目前世界上还没有小花万代种苗繁殖专利和文献报道。因此有必要设计一种小花万代兰种苗组织培养繁殖方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小花万代兰种苗组织培养繁殖方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小花万代兰种苗组织培养繁殖方法，包括下列步骤：

第一步：外植体消毒；

第二步：类原球茎诱导培养；

第三步：类原球茎增殖培养；

第四步：类原球茎分化培养；

第五步：生根壮苗培养；

第六步：出瓶移栽。

优选的技术方案为：在采集外植体30天前，先用500-800倍的多菌灵浇灌小花万代兰植株，并喷施小花万代兰植株的叶片，一周之后再用质量分数为72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000-4000倍体积的水溶液浇灌小花万代兰植株，并喷施小花万代兰植株的叶片，然后用解剖刀对所述小花万代兰植株的顶芽进行切取，获得长度为2~4厘米的顶芽为外植体。

优选的技术方案为：先用干燥的棉花擦拭所述外植体，再用乙醇浸泡的棉花擦拭，然后将外植体切成小段，每段包含至少一个芽点，再用乙醇浸泡，然后用无菌水清洗，接下来用HgCl₂浸泡，然后用无菌水清洗，吹干水分后剥去苞叶，再用HgCl₂浸泡，吹干水分后得到吹干的嫩芽。

优选的技术方案为：于无菌条件下，对所述吹干后的嫩芽进行切取，获得高度为1~2厘米的带节的茎段和顶芽，然后接种到类原球茎诱导培养基上，所述茎段节位和顶芽基部节位有腋芽产生，外植体基部切口膨大形成颗粒突起后，转移到新的类原球茎诱导培养基进行培养，获得类原球茎繁殖材料；培养条件为：温度为23~27℃，光照度为1500～2000lx，光照时长为11~13h/天；所述类原球茎诱导培养基的pH 值为5.4-5.6；每升所述类原球茎诱导培养基含有1～2g的花宝1号、1～2g的花宝2号、20～40mg的硫酸亚铁、20～40mg的乙二胺四乙酸二钠、0.5～2g的蛋白胨、50～100mL的椰子汁、80~120mg的肌醇、1.5~2.5mg的甘氨酸、0.05~0.2mg的盐酸硫胺素、0.4~0.8mg的盐酸吡哆醇、0.4~0.8mg的烟酸、5.0~8.0mg的 6-苄基嘌呤、0.2~2mg的萘乙酸、15～30g的蔗糖、6～7g的琼脂。

优选的技术方案为：将所述类原球茎繁殖材料转接至增殖培养基进行培养，获得增殖的类原球茎繁殖材料；培养条件为：温度为23~27℃，光照度为1500～2000lx，光照时长为11~13h/天；所述增殖培养基的pH 值为5.4-5.6；每升所述增殖培养基含有1～2g的花宝1号、1～2g的花宝2号、20～40mg的硫酸亚铁、20～40mg的乙二胺四乙酸二钠、0.5～2g的蛋白胨、40～80g的土豆泥、80~120mg的肌醇、1.5~2.5mg的甘氨酸、0.05~0.2mg的盐酸硫胺素、0.4~0.8mg的盐酸吡哆醇、0.4~0.8mg的烟酸、2.0~5.0mg的6-苄基嘌呤、0.2~0.5mg的萘乙酸、15～30g的蔗糖、6～7g的琼脂。