[发明专利]一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法

权利要求书

1.一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将待检物质中所含菌的菌体细胞进行破碎处理释放出DNA，萃取除杂后获得粗提DNA溶液，

2)向步骤1)的粗提DNA溶液中加入活化好的氨基磁珠，孵育捕获粗提DNA溶液中的DNA；

3)建立阪崎克罗诺杆菌的特异性PCR扩增反应，以步骤2)捕获到的DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR产物；

4)设计阪崎克罗诺杆菌的DNA探针，将胶体金与DNA探针进行孵育，然后加入磷酸缓冲液进行老化，获得胶体金探针；

5)将步骤3)获得的PCR产物与步骤4)获得胶体金探针进行混合杂交，然后加入MgSO₄溶液后5min内观察颜色变化，若溶液仍呈现红色表明该待检测物质中含有阪崎克罗诺杆菌，若溶液由红色变成蓝紫色表明该待检测物质中不含有阪崎克罗诺杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)是将待检物质离心后重悬于pH为4-11的TE buffer溶液中，添加0μL-50μL蛋白酶K孵育，然后在90℃-100℃下高温处理后进行冰浴，再用体积比为25:24:1的苯酚-氯仿-异戊醇溶液进行萃取，获得粗提DNA溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述活化好的氨基磁珠的添加量为：每10mL粗提DNA溶液中加入0.1mg活化好的氨基磁珠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述孵育捕获是在40℃-80℃下孵育捕获15min-1h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述胶体金按照每900μL胶体金对应0.5nmol阪崎克罗诺杆菌DNA探针进行孵育，其中胶体金的直径为15nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述加入磷酸缓冲液进行老化是：先加入100μL0.1M磷酸缓冲液，然后分多次缓慢加入0.01M的磷酸缓冲液，使最终胶体金探针溶液中NaCl的浓度达到0.7M，其中0.1M磷酸缓冲液的成分为：0.1M Na₂HPO₄，0.1MNaH₂PO₄，0.1％(m/v)SDS，pH为8；0.01M磷酸缓冲液的成分为：0.01M Na₂HPO₄，0.01MNaH₂PO₄，2M NaCl，0.01％(m/v)SDS，pH为8。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述胶体金探针与PCR产物的体积比为3:7-7:3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述MgSO₄溶液的浓度为150mM-350mM，添加量为5μL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的杂交时间为5min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述阪崎克罗诺杆菌的特异性PCR扩增反应中引物对的核苷酸学列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；步骤4)所述阪崎克罗诺杆菌的DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。