[发明专利]一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，属于食品安全技术领域。该方法是将待检物质中的菌体细胞进行破碎处理释放出DNA，萃取除杂后获得粗提DNA溶液，向粗提DNA溶液中加入氨基磁珠，孵育捕获DNA；建立阪崎克罗诺杆菌特异性PCR反应，以捕获的DNA为模板进行PCR扩增；设计阪崎克罗诺杆菌的DNA探针，将胶体金与DNA探针进行孵育，然后进行老化获得胶体金探针，将PCR产物与胶体金探针混合杂交，加入MgSO₄溶液观察颜色变化。本发明方法步骤简单，特异性好，用时较短，可以实现快速检测，无需抗体等昂贵试剂，成本低。本发明适用于快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌。

技术领域

本发明涉及一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，原阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)，是一种含周身鞭毛、能运动并兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢的粗短杆菌。该菌可引起婴幼儿死亡，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，报告病例的病死率达20％～50％，幸存者常有严重的神经系统后遗症。阪崎克罗诺杆菌是婴儿配方乳粉主要的微生物安全指标，阪崎克罗诺杆菌的检测与控制已经成为影响婴儿食品安全的重要因素。因此建立一种高效、快速的检测方法尤为重要。

与传统的基于微生物培养的检测方法相比，聚合酶链反应(PCR)是细菌检测的一个里程碑，PCR反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它最大特点就是能将微量的DNA大幅增加。因此从理论上来说，很少的菌就能在很短的时间内被检测到。然而当PCR用于检测阪崎克罗诺杆菌的主要污染源奶粉时，由于奶粉中的基质比较复杂，使得获得的DNA纯度不高，含有较多的脂肪蛋白质等物质，而这些物质会对PCR产生强烈的抑制作用，进而在PCR过程中会出现即使菌体DNA浓度很高，也仍然扩不出条带的现象，因此在PCR 之前进行样品的分离富集是非常有必要的。对样品的分离富集的方法比较常见的是免疫磁分离技术，但是免疫磁分离技术需要特异性的抗体，抗体制备难度非常大、成本高等问题都限制了它的发展。同时PCR技术还有一大急需解决的问题，即通过PCR的检测结果需经过琼脂糖凝胶电泳来观察结果，此方法需要复杂昂贵的大型仪器，同时需要使用易制毒的染色剂EB，除此之外，此方法耗时长，步骤繁琐，包括制胶、点样、跑电泳等过程，整个过程至少需要一个小时的时间。

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团如氨基，能同核酸发生吸附反应。纳米金比色法是通过纳米金聚集前后，吸收峰发生红移而导致的胶体金颜色变化来观察PCR扩增的结果。

CN105950471 A公开了一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用，该方法利用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌菌体，该方法中存在抗体成本高，灵敏度低，检测耗时长等缺点。

发明内容

为解决现有技术中基于免疫磁珠技术捕获克罗诺杆菌的方法需要特异性的抗体，而抗体制备难度非常大、成本高，不适用于批量现场检测的问题，本发明提供了一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，该方法是将基质中的菌进行破碎，用氨基磁珠捕获释放出的DNA后进行PCR扩增，扩增产物与DNA探针修饰的胶体金进行杂交，最终通过加盐后胶体金颜色的变化直接肉眼观测检测结果。

本发明所述方法包括如下步骤：

1)将待检物质中所含菌的菌体细胞进行破碎处理释放出DNA，萃取除杂后获得粗提DNA 溶液，

2)向步骤1)的粗提DNA溶液中加入活化好的氨基磁珠，孵育捕获粗提DNA溶液中的DNA；