[发明专利]利用蓝藻蛋白RbrA直观检测目的蛋白表达纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种直观检测目的蛋白表达和纯化的方法，特别涉及一种利用蓝藻含铁紫红色蛋白RbrA来直观检测目的蛋白表达和纯化的方法。

背景技术

蓝藻是一种能进行光合作用的原核生物，含有许多与光合作用相关的氧化还原蛋白，RbrA就是其中一种可溶性含铁蛋白。RbrA蛋白属于Ferritin-like家族，其中的rubredoxin结构域含有Fe(SCys)₄中心，其中的Fe原子容易在空气中氧化而呈现紫红色。而在大肠杆菌中重组表达的RbrA蛋白由于处于氧化态而呈紫红色。

目的蛋白在原核系统中的表达和纯化是分子生物学研究和生物技术产业化发展过程中的重要工具，是对目的蛋白功能和性质研究的基础，更促进了现代生物学科迅猛发展。在各种版本的分子生物学实验指南中，目的蛋白的表达和纯化的基本流程是：1、将目的基因克隆入合适的表达载体后导入原核细胞表达系统菌株；2、诱导表达菌株表达目的蛋白；3、通过目的蛋白所带的融合标签如GST、His等，选择不同性质的柱料将目的蛋白与其它蛋白分离，从而达到纯化目的蛋白的目的。

然而目前没有直观实时检测目的蛋白的表达纯化情况的方法。根据目前主流的实验技术，无论先小量诱导检测目的蛋白是否表达，还是最后检测是否通过柱料得到了纯化了的目的蛋白，都需要将蛋白样品通过十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)然后蛋白染色的方法来检测目的蛋白的表达纯化情况。SDS-PAGE检测蛋白样品需要将蛋白样品制样(加loading buffer)，配置聚丙烯酰胺凝胶，然后跑大约1个小时的蛋白电泳，最后还需要将蛋白染色才能最终知道目的蛋白是否已经表达或者得到纯化，这些检测需要额外的步骤和时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种直观实时检测目的蛋白表达和纯化的方法，以解决目前体外表达纯化的目的蛋白需要通过SDS-PAGE来检测、需要大量额外的时间来进行实验操作和其它实验试剂的配制，并且不能实时直观检测的技术问题。本发明通过将目的蛋白与蓝藻含铁紫红色蛋白融合表达来检测目的蛋白的表达和纯化情况，提供了一条便捷直观的方法。

为解决上述技术问题，本发明将目的蛋白与蓝藻含铁紫红色蛋白RbrA或其同源蛋白融合表达，由于RbrA蛋白含有Fe(SCys)₄中心而呈现红紫色，所以整个融合蛋白也呈现红紫色。通过观测融合蛋白的颜色来判断目的蛋白是否已经成功表达和/或纯化，从而构建了一种直观实时检测目的蛋白表达纯化的便捷方法。具体的，本发明的技术方案如下：

一种直观检测目的蛋白表达纯化的方法，构建目的蛋白基因与蓝藻rbrA基因或其同源基因的融合基因，并将含该融合基因的表达载体转入表达菌种中进行表达，通过观察表达菌液破碎后的上清液和/或其纯化组分的颜色来判断融合蛋白是否被成功表达和/或纯化，如果上清液和/或纯化组分偏紫红色，说明目的蛋白与蓝藻RbrA蛋白或其同源蛋白一起被表达和/或纯化。

进一步的，在对表达的融合蛋白进行柱纯化的过程中，通过观察柱料是否变为紫红色可以判断目的蛋白是否结合上柱料。

上述方法中，所述蓝藻rbrA基因或其同源基因编码的蛋白属于Ferritin-like家族，这些蛋白中的rubredoxin结构域含有Fe(SCys)₄中心，其中的Fe原子容易在空气中氧化而呈现紫红色，使得整个融合蛋白呈现紫红色。

蓝藻rbrA基因在鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120的基因编号为alr1174，编码的蛋白为RbrA。RbrA蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，其Rubredoxin结构域中的Fe(SCys)₄中心的4个半胱氨酸为别位于第185、188、218、221位，所以第160～237位的氨基酸是RbrA蛋白显紫红色的关键结构域。rbrA基因可以是序列表中SEQ ID No：2所示的DNA分子。当然，由于密码子的简并性，其它与SEQ ID No：2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的DNA分子也可以用于构建本发明的融合蛋白。