[发明专利]一株具有绿色荧光标记的PRRSVXH‑GD毒株及其构建方法

权利要求书

1.一株具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株，其特征在于是将经TRS6改造的绿色荧光标记EGFP基因插入至PRRSV XH-GD基因组ORF1b和ORF2a非结构蛋白之间。

2.根据权利要求1所述的具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株，其特征在于：

所述的TRS6的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株，其特征在于：

所述的EGFP基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1～3任一项所述的具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取PRRSV XH-GD毒株RNA，并反转录，得到cDNA，备用；

(2)引物序列设计如下：

EGFP-TRS6-1-2-F：5'-GGACGAGCTGTACAAGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAG-3'；

TRS6-2-ORF2-F：5'-CTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGAAATGGGGTCCATGCAA-3'；

14-11F：5'-GGTGCTGGAAAGTGATGTTGG-3'；

14-11R：5'-AAAGCGGGCATACCGTGTAAT-3'；

TRS2-EGFP-F：5'-TTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'；

EGFP-ORF2a-fus-R：5'-tggaccccatttcatTTACTTGTACAGCTCG-3'；

POK-XH-nsp12R：5'-tcaattcaggcctaaagttggttc-3'；

(3)以步骤(1)得到的PRRSV XH-GD cDNA为模板，用引物TRS6-2-ORF2-F和14-11R，14-11F和POK-XH-nsp12R分别进行PCR扩增，获得片段1和片段2；以合成的EGFP为模板，用引物TRS2-EGFP-F和EGFP-ORF2a-fus-R进行PCR扩增，获得片段3；以片段1为模板，用引物EGFP-TRS6-1-2-F和14-11R进行扩增，获得片段4；片段2和片段3进行Overlap PCR，获得目的片段5；再将目的片段5和目的片段4进行Overlap PCR获得目的片段6；将目的片段6与载体POK-A2BCD分别进行双酶切，然后进行重组，得到重组载体；

(4)将重组载体转染细胞，收毒，得到具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株，命名为EGFP-XH-GD。

5.根据权利要求4所述的具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株的构建方法，其特征在于：

步骤(3)得到的目的片段6的序列如SEQ ID NO：10所示。