[发明专利]一株具有绿色荧光标记的PRRSVXH‑GD毒株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蓝耳病毒，特别涉及一株具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株及其构建方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)临床主要引起母猪流产、死胎或木乃伊胎，育肥猪和仔猪的呼吸障碍的传染病。直至今日，PRRS仍在全球大部分地区流行，为严重危害养猪业的主要传染病之一。为抗病毒药物筛选验证，减少相关抗体的使用和操作的工作量，直观且实时的观测病毒在不同药物环境下增值情况。更方便地为研究PRRSV的致病分子机制和为设计基因标记疫苗提供基础。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株。

本发明的目的在荧光显微镜下可以直观的观察其感染过程，且具有什么生物学特性，在且抗病毒药物和PRRSV示踪具有直观，便捷、节省抗体成本

荧光蛋白EGFP的基因以独立转录单元方式插入至PRRSV基因组中，由转录调控序列TRS6启动转录，得到的EGFP-XH-GD株具有和亲本毒较为一致的生物学特性。

具有荧光蛋白基因的EGFP-XH-GD在细胞中的荧光蛋白表达情况可代表PRRSV的感染性，在抗病毒药物功能的验证中具有可视化优势。

为更方便地为研究PRRSV的致病分子机制和为设计疫苗提供基础，显示蛋白对感染细胞的抗病毒效应。

本发明的另一目的在于提供上述具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

PRRS在生产中对养猪业造成重大的经济损失，目前还没有一个有效的方法来根除。在PRRSV的研究中可视化研究相对较少，实验结果的判断不够迅速直观，需要昂贵试剂，不利于推广，可通过病毒可视化可解决。荧光蛋白引入病毒基因组的构建过程为其他外源基因的引进提供操作基础，其在荧光上的物理特性为抗病毒药物的筛选和病毒生物学特征的快速验证提供了便捷，也为PRRSV的精确示踪提供有力的研究工具，对生物体“活”状态下事件的记录和了解生命真实情况的有力手段。PRRSV可视化对了解PRRSV感染和防控具有重要的意义。

本发明提供一株具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株，是将经TRS6改造的绿色荧光标记EGFP基因(EGFP+TRS6)插入至PRRSV XH-GD基因组ORF1b和ORF2a非结构蛋白之间。

本发明基于已拯救的PRRSV XH-GD株，通过向其基因组中引入绿色荧光蛋白(EGFP)来实现PRRSV的可视化。

EGFP被插入至XH-GD基因组ORF1b和ORF2a非结构蛋白之间，作为一个独立转录单元分别由PRRSV转录调控序列TRS6来启动转录，重组病毒在MARC-145细胞上得到拯救。在MARC-145细胞上的研究表明，拯救的病毒EGFP-XH-GD与亲本XH-GD毒株在生长动力学曲线，病毒滴度和噬斑实验等生物学特性上较为一致，且荧光蛋白的表达保持着高效率和稳定的荧光密度和荧光强度。

所述的TRS6的序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的EGFP基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的PRRSV XH-GD基因组的GenBank：EU624117.1。

所述的具有绿色荧光标记的PRRSV XH-GD毒株的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取PRRSV XH-GD毒株RNA，并反转录，得到cDNA，备用；

(2)引物序列设计如下：

EGFP-TRS6-1-2-F：5'-GGACGAGCTGTACAAGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAG-3'；(SEQ ID NO：3)

TRS6-2-ORF2-F：5'-CTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGAAATGGGGTCCATGCAA-3'；(SEQ ID NO：4)

14-11F：5'-GGTGCTGGAAAGTGATGTTGG-3'；(SEQ ID NO：5)

14-11R：5'-AAAGCGGGCATACCGTGTAAT-3'；(SEQ ID NO：6)