[发明专利]猪蓝耳病毒诱导仔猪体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞氧化胁迫模型技术领域，尤其涉及一种猪蓝耳病毒诱导仔猪体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为单股正链RNA病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起妊娠母猪晚期流产、产死胎、木乃伊胎和新生仔猪与生长猪出现呼吸障碍和死亡为特征的传染病。肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophages，PAMs)是PRRSV感染的主要靶细胞。研究表明PRRSV具有独特的细胞嗜性，主要感染单核/巨噬细胞系，可引起PAMs分泌的细胞因子表达下调，部分巨噬细胞的凋亡，导致持续的免疫抑制，从而破坏宿主免疫系统。因此，PAMs在PRRSV的致病过程中扮演着重要角色。在临床上用PRRSV感染仔猪，主要以肺泡巨噬细胞作为研究对象，观察感染后不同时间段细胞内炎性因子的变化，对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染宿主致病机制的进一步研究具有重要的意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种猪蓝耳病毒诱导仔猪体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，为PRRSV感染机体后体内免疫细胞在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供较理想的动物模型。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猪蓝耳病毒诱导仔猪体内免疫细胞氧化胁迫模型的构建方法，采用猪蓝耳病毒PRRSV-GXNN1396株通过滴鼻、肌肉注射两种途径联合感染仔猪，猪蓝耳病毒病毒滴度为4×10⁴TCID₅₀/0.1mL的PRRSV原液。

感染剂量为PRRSV原液4mL/头，感染时间为第1天。

上述构建方法，包括以下步骤：

(1)PRRSV实验性感染仔猪肺泡巨噬细胞方案的选择

选取30日龄，PRRSV/PCV-2抗体及抗原均为阴性的健康仔猪1头，饲养温度恒定在22±2℃，暂养5d使其充分适应环境，以减少应激，并让其自由采食及饮水，仔猪于实验开始前12h禁食，提前6h禁水；

健康仔猪放血致死后，取出完整的气管和肺脏，收集、富集、纯化肺泡巨噬细胞，加入10％RPMI 1640培养液制成5×10⁶单细胞悬液，加入细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养2h，进行分组实验，加入梯度稀释的PRRSV感染细胞后，在不同的时间点检测细胞存活率，进行数据分析，确定PRRSV感染方案；

(2)PRRSV感染健康仔猪氧化胁迫模型的建立

将12头PRRSV/PCV-2抗体及抗原均为阴性的健康仔猪随机分为2组，每组6头，根据步骤(1)确定的方案感染PRRSV，RPMI 1640作对照组；

其中，PRRSV攻毒组：感染PRRSV，4mL/头，分别在第3d、6d处理仔猪；空白对照组：给予RPMI 1640，4mL/头，分别在第3d、6d处理仔猪；

分离肺泡巨噬细胞，用于进行氧化应激相关指标的测定。

氧化应激相关指标包括肺泡巨噬细胞活性氧水平，GSH、NO含量和XOD、MPO、iNOS活性，以及COX-1、COX-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、MCP-1、TNF-α因子水平。