[发明专利]一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞的方法

权利要求书

1.一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)表达基因载体pX330A与pX330S，在BbsI酶切作用下，形成线性化的骨架载体pX330A与线性化的骨架载体pX330S；

2)TRAC与TRBC2及B2M的sgRNA位于基因的外显子，且在基因上的靶序列是唯一的，在设计TRAC与TRBC2及B2M的sgRNA上分别正向寡核苷酸5'加上CACCG，在反向寡核苷酸3'和5'分别加上C和AAAC，将sgRNA寡聚核苷酸双链，混合后于100℃退火5分钟然后慢慢冷却至室温，得到TRAC-sgRNA与TRBC2-sgRNA及B2M-sgRNA；

3)将步骤2)中得到的TRAC-sgRNA和TRBC2-sgRNA分别与步骤1)中线性化的骨架载体pX330A及线性化的骨架载体pX330S进行连接，分别获得含有TRAC-sgRNA的重组载体pX330A-TRAC与含有TRBC2-sgRNA的重组载体pX330S-TRBC2；通过BsaI酶切与T4DNA连接酶将重组载体pX330A-TRAC与pX330S-TRBC2构建至一个载体，得到含有TRAC与TRBC2两个基因sgRNA的重组载体，命名为CRISPR/Cas9-TCR；

所述TRAC的sgRNA序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述TRBC2的sgRNA序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述B2M的sgRNA序列为序列表中SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列；

4)将步骤2)中得到的B2M-sgRNA与步骤1)中得到线性化的骨架载体pX330S进行连接，获得含有B2M-sgRNA的重组载体pX330S-B2M，并重命为CRISPR/Cas9-HLA；

5)利用密度梯度分离新鲜的外周血单核细胞，通过CD3、CD28单抗激活，IL-2培养，激活成T细胞，然后将步骤3)制得的CRISPR/Cas9-HLA与步骤4)制得的CRISPR/Cas9-TCR的质粒共同转染T细胞，进行TCR与HLA双基因敲除，得到TCR与HLA双基因敲除的T细胞。

2.如权利要求1所述的一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞方法，其特征在于，所述步骤5)质粒共同转染T细胞的方法：将含有CRISPR/Cas9-TCR与CRISPR/Cas9-HLA的质粒分别加入电击杯，向电击杯中加入细胞，颠转电击杯使之混匀后，将电击杯放入电击槽中，脉冲电击一次，然后将细胞转移至已含培养基的孔中，轻轻晃动孔板，混匀细胞，电转24h-48h后，基因瞬时表达。

3.如权利要求1所述的一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞方法，其特征在于：将步骤5)制得TCR与HLA双基因敲除的T细胞扩增与测序，将测序后具有敲除效果的转染细胞用生物素标记的TCR抗体和生物素标记的HLA抗体经磁珠分选出TCR与HLA双基因敲除的T细胞。