[发明专利]一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞的方法

说明书

本发明公开了一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞方法，将CRISPR/Cas9‑HLA与CRISPR/Cas9‑TCR的质粒共同转染T细胞，进行TCR与HLA双基因敲除，得到TCR与HLA双基因敲除的T细胞，该发明可以用于异体移植而不会产生免疫排斥。

技术领域

本发明涉及生物基因领域，更具体的说，是一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞的方法。

背景技术

肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，目前至少要有百余种肿瘤，严重危害人类健康。目前，治疗手段主要包括手术治疗、化疗、放疗、单克隆抗体、传统的中药等，然而其治疗效果有限，副作用明显。近年来肿瘤细胞免疫治疗成为最活跃、最有发展前途的一种治疗手段，免疫治疗包括免疫治疗药物和细胞免疫疗法。目前，嵌合抗原受体细胞CAR-T治疗给肿瘤治疗带来了希望，其基本原理是从肿瘤患者自身身体中分离培养的T细胞，利用基因技术对其研究改造，基本过程是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过转染技术，大规模扩增T细胞。然后将这些基因工程改造的细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力，从而达到治疗肿瘤的效果。然而，CAR-T在治疗肿瘤上面也有一些缺点，一方面会引起细胞因子风暴等副作用，另一方面，患者在经过化疗和放疗之后的免疫系统遭到破坏，其自身的T细胞数量、活性及增殖能力极其有限，限制了自体的外周血单核细胞的使用，这对于晚期癌症的病人来说就丧失了最好的治疗方案。所以人们把目光转向一种可异体回输的嵌合抗原受体细胞，一方面健康的捐赠者拥有强的免疫系统够有效杀伤肿瘤细胞，另一方面，其血液易于收集以便分离出T细胞，但是异体回输具有强的移植物抗宿主反应。

T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。TCR可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型，外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞，是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)，编码基因是人类的主要组织相容性复合体(MHC)，位于6号染色体上(6p21.31)，包括一系列紧密连锁的基因座，与人类的免疫系统功能密切相关。MHC其中部分基因编码细胞表面抗原，成为每个人的细胞不可混淆的“特征”，是免疫系统区分本身和异体物质的基础。在进行移植手术时人类白细胞抗原决定组织相容性。贡献者和接受者的人类白细胞抗原越相似，排异反应就越小。只有同卵双胞胎或者克隆的人类白细胞抗原是完全一样的。此外许多疾病与一定的人类白细胞抗原相关联，因此它们对于一定疾病的可能性有关。HLA包括有I类II类和III类基因部分。HLA的I类和II类基因所表达的抗原位于细胞膜上，为MHC-I(A、B、C位点编码)和MHC-II(D区编码)，I类几乎分布于身体全部细胞表面，是一个异二聚体，由重链(α链)与β2微球蛋白组成(B2M)，II类主要是定位于巨噬细胞和B淋巴细胞表面的糖蛋白。

T细胞受体和人白细胞抗原是导致异体回输移植物抗宿主病的主要原因，因此，沉默T细胞的TCR蛋白和HLA蛋白，可实现T细胞的异体回输。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞的方法。

本发明的方案是：

一种制备TCR与HLA双基因敲除的T细胞方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)所述表达基因载体pX330A与pX330S，在BbsI酶切作用下，形成线性化的骨架载体pX330A与线性化的骨架载体pX330S；