[发明专利]一种胚胎体外培养方法

说明书

本发明公开了一种胚胎体外培养方法，具体步骤如下：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO₂、O₂和平衡N₂的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入SOF‑HEPES，然后移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)的培养皿中，培养第3天加入5％血清，待囊胚形成即可。本发明的一种胚胎体外培养方法中主要是去除矿物油的添加，解决覆盖矿物油对添加药物吸附的影响，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。

技术领域

本发明属于胚胎培养技术领域，具体涉及一种胚胎体外培养方法。

背景技术

卵母细胞体外培养是胚胎体外生产的主渠道，培养的效果受动物品种、培养液成份、操作熟练程度等多种因素影响。目前，动物卵母细胞体外培养通常是在四孔培养板或培养皿中添加培养液并在培养液上方覆盖矿物油进行培养。

但是在实际试验中我们发现矿物油会对培养液中添加的部分药物具有吸附作用，降低添加药物的作用效果，掩盖添加药物对牛胚胎发育的真实效果。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种胚胎体外培养方法。本发明的方法通过在胚胎体外培养方法中在培养液上方不覆盖矿物油的方法，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种牛胚胎体外培养方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的培养方法培养得到的胚胎。

技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了一种胚胎体外培养方法，包括以下步骤：

1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO₂、O₂和平衡N₂的气氛中；

2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；

3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF-HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF-HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。

其中，上述步骤1)的胚胎培养液的主要组成成分是KSOMaa和BSA。

KSOM培养基添加氨基酸，是一个成形产品，购买公司为Zenith Biotech，购买网址链接http：//www.zenithbiotech.com/MediaForEmbryoCulture.html。

其中，上述BSA在胚胎培养液中的浓度为4mg/ml。

其中，上述步骤1)的培养皿为4孔培养皿，每孔胚胎培养液有300～500μl。

其中，上述步骤2)的透明质酸酶加入量为500～600μl，所述透明质酸酶浓度为1.0mg/ml。

其中，上述步骤3)中的胚胎清洗次数为3次，胚胎清洗方法为：分别用移液枪吸取SOF-HEPES液体100～200μl，做成液滴1和液滴2，用移液枪吸取预先在二氧化碳培养箱中平衡处理2h以上的胚胎培养液100～200μl，做成液滴3，用拣卵针在体式显微镜下拣取含有SOF-HEPES的混合液中的受精卵至液滴1，再用拣卵针将受精卵从液滴1 中拣取至液滴2，再从液滴2中拣取至液滴3，共完成3次清洗。

其中，在胚胎体外培养过程中胚胎培养液每天进行更换新鲜的胚胎培养液。