[发明专利]稳定的蛋白质

说明书

本申请是申请号为201280049594.4，申请日为2012年8月9日，发明名称为“稳定的蛋白质”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及不易结晶的蛋白，并特别涉及不易稳定并因此不易结晶的GPCR。本发明也涉及使这种蛋白结晶的方法，以及这种蛋白的各种用途。所述蛋白可用于药物发现和开发研究。

背景技术

GPCR组成了控制许多生理过程并且是许多有效药物靶标的一个极大的蛋白家族。特别参照Overington等人(2006)Nature Rev.Drug Discovery 5,993-996，其指出现有药物中超过四分之一具有作为靶标的GPCR。其在药理学上相当重要。在Foord等人(2005)Pharmacol Rev.57,279-288中给出GPCR的列表，通过引用并入本文。

GPCR在分离时通常是不稳定的，并且即使付出相当大努力，才仅可能使包括牛视紫质(bovine rhodopsin)在内的几种GPCR结晶，牛视紫质是天然格外稳定的并且是β-2肾上腺素受体，其作为融合蛋白结晶或者与抗体片段形成复合物结晶。

人们认为GPCR以多种不同构象存在，所述构象与配体的不同药理学种类，如激动剂和拮抗剂相关，并且为行使功能在这些构象之间循环(Kenakin T.(1997)Ann N Y Acad Sci 812,116-125)。在构象之间的转换也导致在获得受体的晶体结构上的困难。

虽然GPCR都具有特征性的7个跨膜(TM)结构域，基于序列同源性和分子结构，仍可将其分为三个家族(A、B和C)。最大的组家族A，由与视紫质同源的受体组成。家族B也称为肠促胰液素受体家族，其是受大肽激素如高血糖素激素家族调节的受体；该家族成员的特征在于含有几个半胱氨酸的相对大的细胞外N端，所述几个半胱氨酸形成二硫桥网络并且是配体结合袋的一部分。家族C由与代谢型谷氨酸受体同源的受体组成；这些受体的特征是极长的细胞外N端和长的羧基尾巴，且所述N端形成配体结合袋，已证明其形成二硫化物连接的二聚体，在形状上类似捕蝇草。

在过去的几年中，已解析一些家族A GPCR的结构，并通过开发一些关键技术已实现这些里程碑。一种这样的技术是将T4溶菌酶(T4L)插入在细胞内的细胞质环(ICL)3中，并认为这样将生成允许形成晶体接触的大亲水区域[2][3]。这种技术与脂立方相结晶学相结合的应用已允许Beta2、A2a、CXCR4和D3受体的高分辨率结构确定[2]。因此，已从这些关于家族A受体的TM束的定位和组织的结构中搜集到重要的信息。然而，几乎没有信息可用于家族B和C受体的成员，而且考虑到高度的序列分歧，在这些家族间的TM结构域的结构和组织上可能存在显著的不同[1]。

在家族A受体中，因为认为螺旋5和6之间的距离与T4L的N和C端之间的距离接近，所以将T4L插入到ICL3中。因此，可能在这个位置容纳融合蛋白，而不认为其它螺旋之间的距离有助于插入融合配偶体。事实上，已将T4L与一些不同的家族A受体在ICL3上相融合，在每种情况下功能蛋白都得以表达并具有受体柔性减少的额外优点，并因此增加整体稳定性。

我们检测了将T4L插入在家族B受体的内环、特别在ICL3中的效果。我们的数据表明家族B受体不能在ICL3中容纳T4L融合，然而令人惊讶和意想不到的是，考虑到家族A受体的结构，将T4L加入ICL2中改善了家族B受体的生物化学性质。ICL2将GPCR包含跨膜螺旋(TM)-1、TM2和TM3的部分连接到GPCR包含TM4、TM5、TM6和TM7的部分。目前的数据表明，与家族A受体不同，在家族B受体中，螺旋3和4之间的距离与T4L的N和C端之间的距离更接近，而不是螺旋5与6之间的距离与T4L的N和C端之间的距离更接近。因此，认为在GPCR的这两个部分之间插入稳定的蛋白结构域代表了之前未能预测到的促进GPCR结晶的新技术。

发明内容

因此，本发明的第一方面提供融合蛋白，其从N端到C端包含：

a)家族B的G蛋白偶联受体(GPCR)的第一部分，其包含GPCR的TM1、TM2和TM3；

b)稳定的蛋白结构域；以及

c)GPCR的第二部分，其包含GPCR的TM4、TM5、TM6和TM7。