[发明专利]一种制备高纯河豚毒素的方法

权利要求书

1.一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）将河豚内脏捣碎、匀浆，倒入pH值为3.5-4.5的醋酸水溶液加热煮沸，冷却后加入与醋酸水溶液等体积的甲醇-水溶液，经200-300r/m转速搅拌后用筛绢过滤收集滤液，滤渣重复上述操作3-5次，将滤液合并后以板框压滤机压滤得到橙黄色毒液；

2）橙黄色毒液浓缩脱脂后，在低温条件下以活性炭脱色纯化，滤出活性炭，再加入大孔吸附剂同时以90-120r/m转速搅拌进一步吸附纯化，反应30-35min，布氏漏斗抽滤得到浅黄色毒液；

3）将浅黄色毒液通过阳离子交换树脂柱，至树脂吸附至饱和状态后以去离子水洗阳离子交换树脂柱，再以醋酸-醇-水体系溶液洗脱，收集洗脱液；

4）对洗脱液进行冷冻干燥和减压浓缩，至洗脱液体积减少至原体积的1/3-1/4得到浓缩河豚毒素毒液，以纳滤膜对浓缩河豚毒素毒液进行纳滤收集滤液，再对滤液重复进行三次纳滤处理，得到无杂质河豚毒素毒液；

5）将无杂质河豚毒素毒液通过交联葡聚糖凝胶柱，以去离子水洗交联葡聚糖凝胶柱，再用pH值为3-4的醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液得到液态河豚毒素粗品；

6）向液态河豚毒素粗品中滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到河豚毒素粗品；

7）将河豚毒素粗品溶于以醋酸-醇体系溶液溶解，再滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到所需河豚毒素。

2.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤1）中甲醇-水溶液中甲醇含量为8-10%，筛绢孔径为350目。

3.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤2）中所述低温为2-5℃；大孔吸附剂为D101大孔吸附剂或D201大孔吸附剂中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤3）醋酸-醇-水体系溶液中醇为甲醇或乙醇中的至少一种，醋酸含量为0.8-1.2%，醇含量为10-12%，余量为水。

5.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤4）中纳滤所施外压为0.1-6MPa，纳滤膜孔径为1-10nm。

6.根据权利要求1或5所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤4）中纳滤所施外压优选为0.2-0.3MPa，纳滤膜孔径为1-2nm。

7.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤5）中交联葡聚糖凝胶柱型号为Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150和Sephadex G-200中的任意一种。

8.根据权利要求1和7所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤5）中交联葡聚糖凝胶柱型号优选为Sephadex G-10。

9.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤6）和步骤7）中所述低温为2-8℃，优选为2-5℃；低压为0.1-10Pa，优选为0.8-1.1Pa。

10.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，所述步骤6）和步骤7）中滴加氨水调节pH值均优选为调节pH值至9.2-9.5。