[发明专利]一种制备高纯河豚毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学物质提取领域，尤其涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化、高效地提取生产高纯河豚毒素的方法。其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。

背景技术

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种由河豚鱼内脏提取的低分子量生物碱类物质。由于其独特的化学结构使其成为细胞钠离子通道专一阻断剂。因此其在生物学研究领域作为生物试剂有着不可替代的位置。河豚毒素在医学临床上所显示的药理学作用，早在上世纪30年代就已有用于临床介断生物碱类成瘾性病症的报道。在镇痛治疗方面也不断有报道推出。因此，其无论在生物学研究领域还是在医学临床应用方面，都显示了十分重要的地位。

TTX是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX的活性基团是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羟基，胍基在生理pH值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。钠离子受体至少有6个特异性靶分子结合位点，TTX是与钠通道受体部位I结合。TTX受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，TTX特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，TTX对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。

TTX由于在极微量的情况下就能阻断细胞钠离子的通道，而对钾离子通道没有影响，具有高度的转移性，因此是十分有用的神经生理研究用工具药。

临床医学上已证明TTX是良好的镇静剂、解痉剂、镇痛剂，特别对癌症等恶性疼痛具有良好的镇痛作用，与传统的杜冷丁、吗啡等镇痛药相比虽然响应时间稍长，但其镇痛作用可达12-20小时，而且无成瘾性。近来TTX在戒毒方面也显示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射10μgTTX一针，5-7天为一个疗程，毒瘾即可得到控制，并可大大减轻一般戒毒中常常出现的戒毒综合症。

但河豚毒素注射液(水溶液)对温度很敏感，容易受温度的影响而发生降解，温度越高，降解越快。一旦有效活性物质河豚毒素含量低于其标示量的90％或有关物质的相对含量超过医药标准规定限度(大于对照溶液主峰面积)就不符合临床使用要求。试验证明，河豚毒素注射液(水针剂)在室温下不稳定，为了保证河豚毒素注射液的质量，防止河豚毒素含量下降和有关物质含量升高，必须将其置于4-8℃冰箱中保存。这就给河豚毒素的临床适用带来诸多困难和不便，相应在贮存、运输、装卸、批发、零售、医院和应用各个环节都得注意保持4-8℃低温，否则温度偏高可能影响临床效果，对此，必须设法尽快予以解决，研制出安全稳定，室温下就能长期贮存的可靠产品。为了解决上述问题，一个简单的做法是将河豚毒素做成冻干制剂。一般在水溶液中不稳定的生物活性物质在冻干脱水后贮存期都可延长，待临床应用时，加灭菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于医药时，其每剂量的用量只有0.5-60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中经冻干脱水后形成不了所要求的固态残留物，必需加入医药上能接受的赋形剂，才能提供微量河豚毒素得以附着的支架，在溶液冻干脱水后能形成固态物。

虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题。

中国专利局于2008年6月18日公开了一种河豚毒素制备方法的发明专利，授权公开号为CN101891751B，该发明专利采用氨基酸作助溶剂，不仅能起到助溶剂的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，还能与河豚毒素形成高水溶性的盐溶液，提供了一种生产纯度较高、杂质较少河豚毒素的方法，但该技术方案同样存在着制备周期过长、不宜用于大规模产业化生产等方面的缺陷。

发明内容

为解决上述虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高于99.5％，直接符合生物学研究和临床应用的要求。