[发明专利]基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法

权利要求书

1.一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液，其中，n≥2；步骤二、制备n份待检测标准溶液；其特征在于，制备n份待检测标准溶液具体为：向双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35-39℃，反应110-130min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6-10min后得多份待检测标准溶液。

2.如权利要求1所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤二中双链DNA溶液的制备方法具体为：将凝血酶适配体DNA溶液加入缓冲溶液中并加入互补单链DNA溶液，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温，得双链DNA溶液，其中，缓冲溶液为pH为7.4，浓度为0.075mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，凝血酶适配体DNA溶液和互补单链DNA溶液体积比为1：1，浓度比为1:1。

3.如权利要求2所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤一中，n＝10，10份凝血酶标准溶液的浓度分别为：0mol/L，5×10^-10mol/L，1×10^-9mol/L，2×10^-9mol/L，5×10^-9mol/L，1×10^-8mol/L，2×10^-8mol/L，4×10^-8mol/L，6×10^-8mol/L，1×10^-7mol/L；

步骤二中，将双链DNA溶液分为10份，每份中加入的凝血酶标准溶液的体积均为20μl，10份待检测标准溶液中双链DNA的浓度均为1×10^-8mol/L，荧光素标记DNA的浓度均为1.5×10^-8mol/L，氧化石墨烯的浓度均为65mg/ml，内切酶Nb.BbvCI为10U。

4.如权利要求1所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，还包括：步骤三、绘制线性方程，具体为：

设定激发波长为496nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm，用RF-6000荧光分光光度计，检测每份待检测标准溶液的荧光光谱图，并得到每份待检测标准溶液在发射波长为522nm处的荧光强度，以每份待检测标准溶液的荧光强度为纵坐标，对应待检测标准溶液的凝血酶浓度为横坐标作标准曲线，得线性方程。

5.如权利要求2所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温具体为：置于水浴锅中升温至93-97℃后，关闭水浴锅开关，至水浴锅内水体温度冷却至室温。

6.如权利要求1所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，多份待检测标准溶液中CutSmar缓冲液与待检测标准溶液的体积比为1:100，每毫升CutSmar缓冲液中包括：50mmol乙酸钾、20mmol三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、10mmol乙酸镁、及100μg牛血清白蛋白。

7.如权利要求1所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，氧化石墨烯分散液在添加前超声8-12min。

8.如权利要求2所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，凝血酶标准溶液、凝血酶适配体DNA溶液、及互补单链DNA溶液的溶剂为蒸馏水或Tris-HCl缓冲溶液中的一种。