[发明专利]基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法

说明书

本发明公开了一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液；步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：将双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，继续添加氧化石墨烯分散液，得多份待检测标准溶液；步骤三、绘制线性方程。本发明具有方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中对凝血酶的高灵敏识别，对凝血酶的检出限达0.39×10^‑9mol/L。

技术领域

本发明涉及凝血酶检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法。

背景技术

抗体虽然用于生物识别元件从发现到发展已有70多年，但是一系列缺陷(储存时间短、易降解、对pH、温度、酸碱度敏感等)不可避免地摆在人们面前。在生物检测中理想的传感器模型应该是响应快、耗时短、灵敏度高、易于小型化的，发展能够克服抗体的缺陷的类抗体物逐渐成为研究的热门。核酸适配体因亲和力强、特异性高、获得途径简单、稳定性好等诸多优点，成为了最具潜力替代抗体的生物分子识别物质，使其在近年得到了快速发展。

目前，研究如何利用适配体作为传感器建立高效、高灵敏、高特异性的的检测目标分子的新方法成为新趋势。本文选用凝血酶作为研究模型，建立利用适配体传感器检测的新方法。凝血酶是一种重要的多功能蛋白酶，催化纤维蛋白原转化撑纤维蛋白，参与凝血联级过程的各个环节，促进凝血，在生物、化学、药理等领域有着广泛的应用，浓度变化异常会导致一些疾病的发生，如血栓、弥散性小管内凝血等，因此血液中凝血酶含量的测定对人体健康非常重要。传统的检测凝血酶方法技术复杂，时间长，近年来，利用适配体凝血酶的检测方法也非常多，但仍存在操作方法复杂、反应时间长、灵敏度不高等缺陷。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中对凝血酶的高灵敏识别，对凝血酶的检出限达0.39×10^-9mol/L。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液，其中，n≥2；

步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：向双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35-39℃，反应110-130min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6-10min后得多份待检测标准溶液。

优选的是，步骤二中双链DNA溶液的制备方法具体为：将凝血酶适配体DNA溶液加入缓冲溶液中并加入互补单链DNA溶液，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温，得双链DNA溶液，其中，缓冲溶液为pH为7.4，浓度为0.075mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，凝血酶适配体DNA溶液和互补单链DNA溶液体积比为1：1，浓度比为1:1。