[发明专利]一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L．)是全球三大主要粮食作物之一，是全球22亿人口包含我国65％以上人口的口粮。水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。水稻生产面临着各种非生物胁迫，例如：干旱、盐害、冷害、高温等。水稻非生物胁迫成为21世纪农业面临的重要问题之一。

水稻是对盐害极其敏感的作物，盐害已经成为影响水稻生长的主要非生物胁迫因素。目前，全世界6％以上的陆地表现出盐碱化；可耕地中19.5％的水田和2.1％的旱地受到不同程度的盐害。水田盐害主要是人类不当灌溉引起的次级盐害，我国水田的15％受到次级盐害的影响。在这些土地贫瘠产出量低的盐渍化地区，培育耐盐作物显得尤为重要。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：SKC1, DST, OsRR22,HAL2, P5CS, CMO, BADH, mtlD, gutD和SAMDC等。其中，OsRR22是调控水稻耐盐性的最重要基因之一。OsRR22基因编码一个696个氨基酸的B型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。

CRISPR/Cas9系统是近几年发展的一种准确、便捷、高效率的生物基因组编辑方法。CRISPR/Cas9 的原理是crRNA（CRISPR RNA）通过碱基配对与tracrRNA（transactivating CRISPR RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA双元复合体，此复合体引导内切酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计改造这两种RNA，可以形成单个具有引导作用的sgRNA（single-guide RNA），足以引导Cas9 核酸酶对DNA 进行定点切割。它可以对任何靶位点后紧随NGG（PAM）的20bp序列进行定点编辑。目前，CRISPR/Cas9系统不但在酵母、果蝇、鼠、人等生物中，而且已成功在拟南芥、烟草、水稻、小麦、高粱等植物中实现了定点基因组编辑。但是，对水稻育种中有重要价值的产量、抗性、育性等关键基因的定点编辑研究鲜有报道，更缺乏对优良水稻优良亲本进行基因编辑改良的报告。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种提高了耐盐性并保持了其自身优良综合农艺性状的水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（二）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（三）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，包括以下步骤：

S1、引导RNA靶点序列设计与选择：根据控制水稻耐盐基因OsRR22的基因组序列和CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，设计、选择并合成1个OsRR22引导RNA靶点序列；

S2、CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建：将步骤S1中合成的引导RNA靶点序列退火形成双链，与BsaI酶切后的pYLgRNA-OsU3/LacZ连接得到gRNA表达盒，然后通过Golden gate cloning方法将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到CRISPR/Cas9-gRNA载体；

S3、农杆菌介导水稻愈伤遗传转化：将步骤S2构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体转化到水稻品种WDR58中，获得了不含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合OsRR22基因突变体。

进一步的，在所述步骤S1中，靶位点设计在OsRR22基因的第一个外显子上；

所述步骤S1中，所述的OsRR22引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为：

RR22-F:5’-ggcAGAGGGATCAATTCCCCGT-3’

RR22-R:5’-aaacACGGGGAATTGATCCCTCT-3’。

进一步的，在步骤S2中，所述Golden gate cloning方法中用到的引物为：

U3-F: 5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’