[发明专利]一种层析介质及其制备方法

说明书

本发明公开了一种层析介质及其制备方法。本发明的层析介质包括层析基质和功能配基，所述层析基质为琼脂糖凝胶微球，所述功能配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N‑苄基‑N‑甲基乙醇胺。本发明的制备方法包括下述步骤：1)将层析基质用烯丙基缩水甘油醚活化，得到活化后的层析基质；2)将步骤1)中活化层析基质用溴水进行溴化，以形成溴化后的层析基质；3)将步骤2)中溴化的层析基质与功能配基N‑苄基‑N‑甲基乙醇胺反应，以形成层析介质。本发明的层析介质制备过程简单、抗体吸附容量大，通过改变pH可以在实现抗体的吸附和洗脱的同时较好去除脱落的蛋白A，可以利用蛋白A捕获和该介质的精纯实现抗体的两步纯化。

技术领域

本发明属于生物化工领域中的蛋白质层析分离领域，具体涉及一种层析介质及其制备方法。

背景技术

随着现代生物技术的快速发展，对生物分离方法也提出了新的要求，越来越多的生物产品需要高效的生物下游技术进行分离和纯化。其中层析技术是目前最有效的生物分离纯化技术，而层析介质是层析技术的关键与核心。

对于抗体的分离纯化备受关注。抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用小的特点，广泛应用于肿瘤及自身免疫病等重大疾病治疗、体外诊断与检测，成为当前生物技术药物的重点发展方向。目前通过哺乳动物细胞培养，抗体的表达量可以达到5g/L以上，但是抗体下游分离纯化过程成本较高，成为了抗体药物快速发展的瓶颈。抗体产品纯度要求较高，还必须保持生物活性，分离纯化的难度较大。离子交换层析和疏水相互作用层析等技术虽然可以分离抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体的纯度和活性收率。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析，是目前抗体分离的关键技术，选择性高、特异性强，但介质价格昂贵，吸附容量有限，且蛋白类亲和配基易被降解而脱落，重复使用次数有限，洗脱条件受限，因此操作成本较高。

1998年，Burton和Harding(Burton and Harding，J.Chromatogr.A,1998,814:71)提出了以疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatorgraphy,HCIC)为代表的新方法—多模式混合层析技术(Mutilmodal-mixed chromatography,MMC)，有效地结合了静电、疏水、氢键和亲硫等多种相互作用，在中性pH条件下，配基不带电荷，可以通过疏水等相互作用与目标蛋白结合，通过调节溶液pH，使配基带上电荷，通过静电排斥作用与目标蛋白解离，从而实现洗脱。MMC具有对目标蛋白选择性高、洗脱条件温和、介质再生简单等优点，可以有效调控对目标蛋白的吸附与解吸，显示出良好的应用前景。美国专利5,652,348描述了以巯基杂环化合物作为配基的MMC介质及其制备方法。美国专利7,144,743、5,719,269也报道了MMC介质的制备工艺。专利CN101284224、CN101279243、CN101279244报道了在MMC介质空间臂中引入砜基来提高介质对抗体的选择性及相关制备方法。专利CN104096544、CN104117345报道了以氨基苯并咪唑为配基以及色氨酸和氨基苯并咪唑为双功能基团的MMC介质。这些MMC介质主要以疏水相互作用与抗体结合，配基含量不高，吸附性能有限，一般需要结合传统的离子交换层析才能对抗体达到分离的目的，纯化效率并没有得到明显的改善。此外，这些MMC介质不能很好地去除纯化过程中在抗体中脱落的蛋白A。另外，常规抗体纯化方法需要蛋白A纯化后再由离子交换层析和疏水作用层析依次纯化，需要三步才能实现纯化。该常规方法耗时、步骤多，导致纯化成本比较高。因此，非常需要开发能够结合蛋白A的两步纯化抗体、提高纯化效率、降低分离成本，同时提高对抗体中脱落蛋白A的去除的MMC新型介质。

发明内容

为了满足上述需求，简化抗体纯化步骤，节约纯化成本，本发明提供了一种多模式混合层析介质。

根据本发明的一个实施方式中，提供了一种层析介质，其包括层析基质和所述层析基质表面上的功能配基，所述功能配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N-苄基-N-甲基乙醇胺，

所述层析介质的结构组成为：