[发明专利]一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从菜籽饼粕中分离纯化的抗炎肽及其用途，属于食品生物技术领域。

背景技术

炎症是机体对其组织和细胞受到有毒刺激和病症时，如感染，组织损伤，组织应激和功能障碍等，作出的直接反应。炎症与整体健康状况密不可分，研究表明癌症的发病机制与炎症有关。关于菜籽生物活性肽的研究已经很多，包括降血压肽，抗氧化肽，抗肿瘤肽等。因此，菜籽蛋白水解具有很大的潜力和广阔的市场前景。

由于目标活性肽在反应体系中含量甚微，菜籽功能肽多数是一些相对分子质量小于5 000Da的短肽，传统分离技术难以达到分离的目的，必须采用膜分离、色谱分离等现代分离技术。目前有关抗炎肽分离纯化的技术较少，而且所得到的活性成分纯度较低，抗炎活力较弱，不能很好的找到抗炎目标组分。

发明内容

本发明的目的是提供一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法，以酶解菜籽蛋白水解物为原料，分离菜籽蛋白水解物以得到具有较高抗炎活性的菜籽肽组分，提高菜籽蛋白的利用。

本发明采用以下技术方案：一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法，包括以下步骤：

a.将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；将得到的菜籽粉用碱提酸沉的方法制得菜籽蛋白，并冷冻干燥；将得到菜籽蛋白用碱性蛋白酶水解和风味蛋白酶进行分步酶解，得到菜籽蛋白水解物；

b.将步骤a得到的菜籽蛋白水解物通过的超滤膜，收集分子量小于3K的组分；

c.将步骤b收集的分子量小于3K的组分通过葡聚糖凝胶柱分离，得到若干组分，并收集具有紫外吸收峰的组分；

d.将步骤c得到的活性较强的组分通过半制备液相分离，得到若干组分，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所述菜籽抗炎肽。

具体的，包括以下步骤：

（1）菜籽蛋白酶解产物的制备：将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；取菜籽粉溶于蒸馏水中，调为pH=11，搅拌1h，离心收集上清液，调上清液的pH为4.5，搅拌1h，再次离心，弃上清液，得菜籽蛋白。取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调pH=9，加入碱性蛋白酶，反应3h后，灭酶，将溶液pH调至7，加入风味蛋白酶，反应2h，灭酶冷却后，过0.22μm微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。

（2）菜籽蛋白的酶解产物的超滤：利用超滤膜分离技术将其进行纯化，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为0.5-1%的溶液后，反复几次通过的超滤膜，使其超滤的压力控制在0~1MPa范围内，收集小于3K的组分，并冷冻干燥。

（3）利用葡聚糖凝胶柱分离纯化步骤（2）中的分子量3K的菜籽肽。葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱条件为：以双蒸水为流动相进行洗脱样品，上样浓度1-10mg/mL，上样体积5-10ml，上样流速9-18 mL/h，洗脱流速9-48mL/h，洗脱温度20-32℃，紫外检测波长为280 nm，洗脱液自动部分收集, 将同一分离峰合并，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性；

（4）用半制备液相进一步分离步骤（3）中活性较强的菜籽多肽组分，液相条件为：洗脱梯度为0-60min，乙腈5-100%；流速为1-2.46mL/min，紫外检测波长215nm，柱温25-35℃，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所得菜籽抗炎肽。

本发明还公开了利用上述经过超滤，葡聚糖凝胶柱，半制备液相分离纯化得到的抗炎菜籽肽。所述抗炎菜籽肽的纯度为90~98%菜籽抗炎肽，在最大纯度的条件下，菜籽抗炎肽的IC50=377.085μg/mL。

本发明的有益效果：

（1）提高了菜籽饼粕的利用价值，可以从酶解产物中分离出一些具有生理活性的生物活性肽；

（2）通过控制葡聚糖凝胶色谱柱的上样浓度，上样体积，上样流速，洗脱流速，洗脱温度来判断合适的分离条件；以及控制半制备液相中液相条件（上样浓度，洗脱梯度，流速，柱温）来找到合适的制备条件。

（3）菜籽抗炎肽的活力较强，可以作为一种功能性食品和膳食补充剂。

附图说明

图1为本发明实施例2步骤（3）处理后的分离组分的NO释放量；

图2为本发明实施例2步骤（4）处理后的分离组分的NO释放量；

图3为本发明实施例2制备菜籽抗炎肽的液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：