[发明专利]一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法，包括如下步骤：

1）根据含有已知序列的单链DNA分子设计合成与所述已知序列互补的引物；该引物中按照5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作防止外切酶外切修饰，5’端碱基用防止外切酶外切修饰，3’端最后一个碱基为特定碱基；

所述含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲和碱基乙；所述碱基甲为所述已知序列中与所述引物中特定碱基对应配对的碱基；所述碱基乙为所述已知序列中从5’端起所述碱基甲上游紧邻的第一个碱基；所述碱基甲和所述碱基乙不同；

2）将固定在固相上的所述含有已知序列的单链DNA分子与所述引物杂交，再用不同的待测核酸酶酶切杂交的产物，得到酶切产物；

3）向所述酶切产物中引入DNA聚合酶和荧光修饰目标dNTP,聚合反应，根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲或所述碱基乙互补；

所述固定在固相上的含有已知序列的单链DNA分子的裸露端碱基进行防止外切酶外切修饰；

所述根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性为如下：

当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲互补时，比较所述不同的待测核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号强的待测核酸酶的对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

或当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基乙互补时，比较所述不同待测的核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

所述含有已知序列的单链DNA分子上还设有碱基丙；

所述碱基丙为所述已知序列中从5’端起所述碱基甲上游紧邻的第二个碱基；

所述碱基乙与所述碱基丙相同或不同；

若所述碱基乙与所述碱基丙相同，则所述荧光修饰目标dNTP的糖环上3’羟基做阻断修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述特定碱基为可切除的碱基；

或所述特定碱基为可切除的碱基，所述可切除的碱基具体为天然碱基、简并碱基、正确碱基、错配碱基或非防止外切酶外切修饰的修饰碱基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

针对碱基的所述防止外切酶外切修饰为磷酸化修饰、硫代修饰或其他防止外切的修饰方式；

针对磷酸二酯键的所述防止外切酶外切修饰为硫酰化或甲基化修饰。

4.一种定量检测待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的方法，包括如下步骤：以已知酶活性的内参核酸酶作为对照，按照权利要求1-3中任一所述的方法的步骤1）-3）分别检测所述已知酶活性的内参核酸酶的荧光强度和所述待测核酸酶荧光强度；再通过计算该待测核酸酶荧光强度与所述内参核酸酶的荧光强度的比值，得到该待测核酸酶的对特定碱基3'-5'外切酶活。

5.一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的试剂盒，包括权利要求1-3任一所述方法中的所述含有已知序列的单链DNA分子、所述引物、 所述DNA聚合酶和所述荧光修饰目标dNTP。

6.权利要求5所述的试剂盒在检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性中的应用；

或权利要求5所述的试剂盒在定量检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活大小中的应用。