[发明专利]一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测核酸酶对特定碱基3'‑5'外切活性的方法和试剂盒。本发明首次提出检测酶对特定碱基的外切活性；利用该发明可以检测任一碱基，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP以及简并碱基等，应用范围十分广泛；该发明可以检测大多数核酸酶的3’‑5’外切活性；使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染，且灵敏度高；无需荧光基团修饰的核苷酸链，成本低；可以用来快速大量地筛选核酸酶，应用灵活，通量高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法和试剂盒。

背景技术

很多核酸酶具有3’-5’的外切活性。检测核酸酶3’-5’外切活性对于了解 DNA聚合酶的校正能力、DNA外切酶的降解速率等具有重要意义。核酸酶对不同碱基(包括各种修饰碱基、简并碱基等)的外切能力不同，对碱基在正确配对和不同形式的错误配对情况下的外切能力也不同。研究核酸酶对某一特定碱基的外切活性对分子生物学研究和药物研发等均有重要意义。

现有的检测3’-5’外切酶活性的技术多是需要放射性标记、凝胶电泳、酶联免疫吸附反应或者合成带荧光基团和淬灭基团的探针等，操作复杂、成本高而且易污染。同时现有的技术不能检测核酸酶针对任一特定碱基的外切活性。

利用放射性同位素检测核酸酶3’-5’外切活性是常用的方法。通过合成一条 3'末端带³H标记核苷酸的寡核苷酸链，利用核酸酶3'-5'外切活性切除该放射性同位素标记的碱基，然后经过一系列复杂的沉淀、过滤等步骤，最后通过测定放射性的含量计算3'-5'外切酶活性。

有研究人员(专利CN104293930 A，一种3'-5'外切酶活性测定方法)将3'端有错配碱基的引物与单链模板混合并退火，加入酶进行3'碱基外切反应，然后加入足量没有3'-5'外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，通过检测反应体系中双链DNA的相对量来推导出外切酶活性程度。

有研究人员(专利CN104293917 B，用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针)通过发明一种具有茎环结构的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针来检测核酸酶的3’-5’外切活性。该探针环部是单链结构，颈部则是双链结构，每两个碱基之间的磷酸二酯键全部硫酰化，只有3’末端的碱基不硫酰化，同时3’末端碱基链接有荧光基团，3’-5’的第四个碱基上含有淬灭基团。在没有目标酶存在时荧光基团与淬灭基团靠近，没有荧光信号，当酶切除了3’端碱基之后荧光基团与淬灭基团远离，荧光信号恢复。通过检测荧光信号来检测酶的外切活性。

放射性同位素法易产生污染，且操作复杂，周期长，难以实现高通量、自动化。专利CN104293930 A中对于外切活性特别高的或者特别低的酶检测结果不能十分准确，所以具有一定的局限性，同时也不能准确地检测出核酸酶对某一个特定碱基的外切活性。专利CN104293917 B需要合成有茎环结构且带有淬灭基团和荧光基团的探针，成本高，同样无法检测核酸酶对某一个特定碱基的外切活性，尤其是由于3’端最后一个碱基带有荧光基团，限制了所能检测的修饰碱基的范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)根据含有已知序列的单链DNA分子设计合成与所述已知序列互补的引物；该引物中按照5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作防止外切酶外切修饰，5’端碱基用防止外切酶外切修饰，3’端最后一个碱基为特定碱基；

所述含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲和碱基乙；所述碱基甲为所述已知序列中与所述特定碱基对应配对的碱基；所述碱基乙为所述已知序列中从 5’端起所述碱基甲上游紧邻的第一个碱基；所述碱基甲和所述碱基乙不同；

2)将固定在固定相上的所述含有已知序列的单链DNA分子与所述引物杂交，再用不同的待测核酸酶酶切杂交的产物，得到酶切产物；