[发明专利]一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法

说明书

本发明公开了一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法。具体是把外源dsRNA均匀混入蔗糖溶液后直接饲喂瓢虫2～3天，而后用豌豆蚜饲喂；然后检测分析目标基因在瓢虫中的表达量变化，并观察瓢虫的生物学变化，用以评价外源dsRNA对瓢虫的毒性；所述瓢虫包括异色瓢虫、七星瓢虫或十二星瓢虫。该方法能够有效测定外源dsRNA对异色瓢虫、七星瓢虫或十二星瓢虫等瓢虫的直接毒性影响，且方法简单可行，有效性和灵敏性好，对相关基因的功能研究以及相关RNAi转基因作物的环境风险评价具有重要的意义和应用前景。

技术领域

本发明属于昆虫分子生物学研究技术领域。更具体地，涉及一种测定外源双链RNA(dsRNA)对瓢虫(异色瓢虫、七星瓢虫或十二星瓢虫)毒性影响的方法，包括外源合成dsRNA或RNAi转基因作物表达的dsRNA对瓢虫(异色瓢虫、七星瓢虫或十二星瓢虫)毒性影响的测定方法。

背景技术

农业转基因技术作为第二次绿色革命的核心技术，快速的重塑了现代农业的格局。1996年转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白基因的抗虫作物开始商业化种植，到2015年种植Bt作物的国家已达28个，年种植面积近27亿亩(http://www.isaaa.org/)。按转基因作物的种植面积对种植转基因作物的国家进行排序，中国列在美国、巴西、阿根廷、印度和加拿大之后，排第6位。2016年中央1号文件强调，要“加强农业转基因技术研发和监管，在确保安全的基础上慎重推广”。2016年8月8日印发的“十三五”国家科技创新规划明确，包括转基因在内的一系列国家重大科技专项将加快实施，核心关键技术要在“十三五”期间持续攻克，推进新型转基因抗虫棉、抗虫玉米等重大产品的产业化进程。所以，未来我国转基因作物的种植面积会进一步加大。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指物种在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象(Fire etal.1998)。近20年来，RNAi的技术和产品快速发展，在科学界、工业界以及社会公众中受到了前所未有的关注。在农业方面，RNAi被认为是具有应用潜力的害虫防治新方法(Gordonand Waterhouse,2007；Huvenne and Smagghe,2010)。基于RNAi技术的抗虫转基因作物已经被证明是可以有效控制鳞翅目、鞘翅目以及半翅目害虫的方法，如玉米根叶甲Diabrotica virgifera virgifera(Baum et al.2007)；马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Zhang et al.2015)；棉铃虫Helicoverpa armigera(Mao etal.2007)；亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Wu et al.2016)；烟粉虱Bemisia tabaci(Thakur et al.2014；Shukla et al.2016)；桃蚜Myzuspersicae(Guo et al.2014)；麦二叉蚜Schizaphis graminum(Zhang et al.2015)；麦长管蚜Sitobion avenae(Xu etal.2014)；褐飞虱Nilaparvata lugens(Zha et al.2011)等。具有良好抗虫性状的RNAi转基因作物已研制成功，预示着其商业化应用成为可能。虽然当前Bt作物防治鳞翅目和鞘翅目害虫仍然有效(Wu et al.2008；Tabashnik et al.2008)，但Bt作物对近年来持续暴发为害的刺吸式口器害虫如蚜虫、叶蝉、飞虱及粉虱等无效。所以，发展RNAi转基因作物将为包括这类害虫在内的防控提供新途径(Price and Gatehouse,2008)，也可为防治鳞翅目和鞘翅目害虫的Bt作物提供重要的轮换。