[发明专利]一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种L‑高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L‑苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。

目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：

(1)化学法；该方法采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；

(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。

(3)生物酶催化法；该方法利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该方法主要问题是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。

(4)微生物发酵法；该方法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，目前的L-高丝氨酸发酵依赖于以质粒为载体的基因过表达体系，其劣势是菌种传代稳定性差。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种稳定的L-高丝氨酸的生产菌株。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的基因工程方法。

因此，本发明提供一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L-苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因。

优选地，所述被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；所述被突变以增强的基因为thrA和/或rhtA，所述整合拷贝的基因为thrA*、ppc、pntA、pntB、asd、aspA和aspC中的一个或多个。

优选地，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。

进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

本发明还提供所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：

A、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；

B、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因通过点突变过表达或增强功能；

C、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达。

优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；

所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA和/或rhtA；